《Food Microbiology》：Metabolomics-based analysis of dynamic metabolic trajectories and regulatory networks in two-stage fermentation of kiwifruit wine
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摘要为精准控制猕猴桃酒的发酵过程，本研究结合非靶向代谢组学与多元统计分析方法，系统分析了酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵这两个阶段中微生物的代谢活动及其对整体代谢轨迹的影响。研究结果表明，这两个发酵过程都对猕猴桃酒的质量有着重要影响，且通过相互关联的代谢途径产生协同作用。代谢途径及相关
摘要
为精准控制猕猴桃酒的发酵过程，本研究结合非靶向代谢组学与多元统计分析方法，系统分析了酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵这两个阶段中微生物的代谢活动及其对整体代谢轨迹的影响。研究结果表明，这两个发酵过程都对猕猴桃酒的质量有着重要影响，且通过相互关联的代谢途径产生协同作用。代谢途径及相关性分析显示，酒精发酵主要涉及营养物质的分解与利用，非酿酒酵母大量繁殖并产生大部分酯类和醇类物质；而苹果酸-乳酸发酵则主要关乎能量供应与有机物质的合成，植物乳杆菌能在营养受限且环境恶劣的条件下生存，并产生具有芳香作用的挥发性物质。相关性分析及代谢途径富集分析进一步表明，非挥发性代谢物的转化与挥发性化合物的产生之间存在密切关联，这体现了微生物代谢在塑造猕猴桃酒风味与品质方面的关键作用。
引言
猕猴桃是中国西北地区的重要经济作物。根据联合国粮食及农业组织的数据，中国的猕猴桃产量一直占据全球总量的50%以上，在国际市场上具有举足轻重的地位。虽然新西兰、智利和希腊等国在鲜果出口领域占据优势，但中国国内市场更倾向于开发功能性食品和饮料等高附加值加工产品（Wang等人，2021）。其中，猕猴桃酒作为价值链中的重要环节，将农业生产与消费者健康需求紧密相连。现代葡萄酒酿造通常包括两个依次进行的发酵阶段：由酵母引发的酒精发酵，以及由乳酸菌启动的苹果酸-乳酸发酵，这两种发酵过程可以是同步进行，也可以是依次进行，具体取决于微生物之间以及底物营养成分之间的相互作用（Lytra等人，2020；Calugar等人，2024）。酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵都会改变葡萄酒的化学成分，前者决定葡萄酒的基本风味特征，后者则影响酸度、微生物稳定性以及二级风味的复杂性（Sant'Ana和Lemos，2024）。尤其是那些经过选择性培育和改良的本地微生物，凭借其独特的代谢模式，能够塑造并提升产品的独特风味，使其具有鲜明的地域特色。
从本质上讲，发酵是一个复杂的生物化学过程，涉及微生物与底物之间的深度交换，包括对代谢流的方向调控、酶活性的时空变化，以及微生物群落间的相互作用（Wang等人，2024）。在整个发酵过程中，代谢物的不断合成与分解共同维持着猕猴桃酒体系的稳态。作为猕猴桃酒风味体系的核心组成部分，非挥发性代谢物和挥发性代谢物通过动态的生物化学网络共同调控葡萄酒的品质（Li等人，2024）。水果汁中含有大量的非挥发性前体物质，如糖类、氨基酸和脂肪酸，这些物质通过微生物代谢（如糖酵解、三羧酸循环和埃利希途径）以及酶促反应，逐步转化为挥发性物质（Wang等人，2024）。此外，一些化合物还能通过改变基质粘度以及分子间相互作用（如氢键或疏水作用），间接调节挥发性化合物的释放平衡，从而影响香气的强度和持久度，这类化合物包括甘油、多糖和酚类物质（Bertelsen等人，2020）。不过需要指出的是，以往关于猕猴桃酒的研究大多侧重于发酵前后成分的差异，重点在于菌株的选择以及发酵工艺的改进，却忽视了不同发酵阶段中代谢物的动态变化以及微生物的适应性调整。
现有研究表明，发酵过程中代谢物组成的动态变化会引发化学反应的转变（Zhao等人，2024；Xu等人，2025），这就为深入探究代谢网络中与状态相关的模式及调控机制带来了巨大挑战。幸运的是，随着痕量分析技术的突破以及代谢组学数据库的不断完善，这一长期存在的科学难题正在逐步得到解决。如今，非靶向代谢组学已成为研究食品体系中动态代谢特征的强大分析工具。基于核磁共振波谱和高分辨率质谱技术的先进代谢组学平台，凭借其极高的灵敏度和特异性，在食品加工过程中对复杂化学成分的系统性表征和实时监测方面展现了巨大的实用价值（Liu等人，2022）。更重要的是，借助小分子代谢组学数据与生物信息学分析，可以实现对关键风味物质代谢变化的动态监测，从而精准控制生产过程中的关键节点，最终实现产品质量与风味特性的同步提升。
在目前的发酵工艺中，经过合理选择和驯化的本地非酿酒酵母因其能够提升风味质量并形成地域特色，已被广泛用于酒精发酵环节（Sun等人，2023）。基于我们研究小组之前的研究成果，先使用非酿酒酵母混合物启动酒精发酵，然后再接入植物乳杆菌进行苹果酸-乳酸发酵，这一方法显著提升了猕猴桃酒的香气复杂性（Sun等人，2025）。基于此，本研究旨在揭示猕猴桃酒在连续两阶段发酵过程中的动态代谢轨迹及调控网络。本研究采用LC-MS和GC-MS技术进行非靶向代谢组学分析，结合多元统计分析和KEGG通路富集分析，对猕猴桃酒发酵过程中非挥发性及挥发性代谢物的变化进行了纵向追踪；同时，通过生物信息学工具进一步分析了相关的代谢途径及其形成机制。此外，还通过相关性分析研究了不同发酵阶段中前体物质与产物之间的关系。这种综合性的研究方法为理解猕猴桃酒发酵过程中代谢物的演变规律以及风味的形成机制提供了重要的理论依据。
章节节选
菌株与原料
在发酵的第一阶段（酒精发酵）中，所使用的两种本地非酿酒酵母分别为鲁氏酵母P-9和吉列尔蒙德梅耶罗酵母B12；而在发酵的第二阶段（苹果酸-乳酸发酵）中，则使用了植物乳杆菌3422。这三种微生物都具有较高的β-葡萄糖苷酶和酯酶活性，同时还具备耐酸和耐酒精的能力，它们均是从猕猴桃表面以及自然发酵过程中分离得到的。
两阶段发酵过程中的动力学参数
图1A–1C展示了猕猴桃酒在两个发酵阶段中的残糖、苹果酸和乳酸含量变化情况。作为微生物生长所需的营养物质，经过26天的完整发酵过程后，猕猴桃酒中仅剩下2.09克/升的可检测糖分，其中大约87%的糖分在第一个发酵阶段被消耗，约13%在第二个发酵阶段被消耗。相比之下，苹果酸和乳酸含量的变化则呈现出明显的不同趋势。
结论
综上所述，本研究探讨了猕猴桃酒两阶段发酵过程中非挥发性及挥发性代谢物的代谢演变规律，并阐明了它们之间的关联网络。研究发现，酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵都是提升猕猴桃酒品质的关键阶段。非酿酒酵母和植物乳杆菌在发酵过程中发挥着各自独特却又互补的作用。在酵母发酵阶段，其主要功能是促进相关物质的转化。
作者贡献说明
韩佳：研究工作。李世奇：软件应用、定量分析。冯思诺：数据整理。王周丽：项目管理。蔡瑞：项目管理、概念设计。孙旺生：论文撰写与修改、初稿撰写、软件应用、方法设计、研究工作、数据整理、概念设计。郭静：论文撰写与修改、资源协调、项目管理、方法设计、概念设计。闫万菊：软件应用、研究工作。毕鹏飞：可视化处理、软件应用。
未引用参考文献
C?lug?r等人，2024；Chen等人，2023；Li等人，2022；Li等人，2021；Liang等人，2020；Sant?Ana和Lemos，2024；Su等人，2024；Valles等人，2005；Wang等人，2020；Yao等人，2023。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
所有署名作者均已阅读并批准了本手稿的内容，此外没有其他符合作者资格但未被列入名单的人士，而且手稿中作者的排序也得到了所有人的认可。
我们已充分考虑到与本研究相关的知识产权保护问题。
致谢
本研究得到了陕西省“重点研发计划”——关键核心技术“突破”项目的支持（项目编号：2024NC-GJHX-24）。同时，我们也感谢西北农林科技大学食品科学与工程学院的仪器共享平台为本研究提供的技术支持。此外，还要特别感谢中国西北农林科技大学的周渊博士在GC-MS分析方面给予的宝贵帮助。
孙旺生|毕鹏飞|闫万菊|蔡柔|张振东|韩佳|冯思诺|李世奇|蔡瑞|王周丽|郭静
中国陕西省杨陵市西北农林科技大学食品科学与工程学院，邮编712100
