《Food Microbiology》：Whole-genome analysis and molecular docking reveal how nucleotide variations in the
aprX gene drive the differential spoilage potential of
Pseudomonas in milk
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摘要假单胞菌是导致乳制品变质的主要嗜冷腐败菌，但亲缘关系密切的菌株之间在腐败程度上的差异其分子机制至今仍不十分清楚。本研究结合全基因组测序、表型组学以及计算结构生物学方法，旨在阐明aprX基因中的核苷酸变异如何影响腐败潜力——这是食品源微生物学中的一个重要问题。通过对具有代表性的
摘要
假单胞菌是导致乳制品变质的主要嗜冷腐败菌，但亲缘关系密切的菌株之间在腐败程度上的差异其分子机制至今仍不十分清楚。本研究结合全基因组测序、表型组学以及计算结构生物学方法，旨在阐明aprX基因中的核苷酸变异如何影响腐败潜力——这是食品源微生物学中的一个重要问题。通过对具有代表性的假单胞菌分离株的aprX操纵子进行系统发育分析，将其分为五种不同类型。通过冷藏模拟实验发现，TA0410和TA0601这两种菌株具有很强的腐败能力，它们会导致pH值迅速下降、胶体稳定性降低，以及κ-酪蛋白完全降解。分子对接实验表明，这些菌株产生的AprX蛋白酶与κ-酪蛋白的切割位点形成的结合更为牢固，氢键网络也更稳定，而那些腐败能力较弱的菌株则无法做到这一点。原子级分析进一步显示，特定的单核苷酸多态性会在功能关键的序列区域引发氨基酸替换——比如催化域中的“HEIGHTLGLDH”以及底物结合区域中的新保守序列“SVMSY”。这些替换会通过改变AprX蛋白酶与其底物之间的静电作用和疏水相互作用，从而直接影响酶的活性。值得注意的是，“SVMSY”序列在腐败能力强的菌株中普遍存在，它是开发新一代分子检测技术的理想靶标，有助于准确判断产品是否存在腐败风险。本研究建立了基因组变异与表型表现之间的机制联系，为乳制品质量控制提供了可行的干预靶点。
引言
乳制品是全球重要的蛋白质来源（Lagrange等人，2015）。由于含水量高且营养丰富，它们很容易受到微生物污染，从而导致经济损失和健康风险（Wang等人，2026）。在冷藏条件下，凭借其嗜冷特性和强大的分泌系统，假单胞菌成为生奶、巴氏杀菌奶以及保质期更长的乳制品中最主要的腐败微生物（Yuan等人，2025）。这类细菌分泌的热稳定性胞外蛋白酶和脂肪酶能够承受常规的热处理，在储存和运输过程中依然保持活性，进而导致乳制品出现凝胶化、变苦、分离和沉淀等不可逆的质量下降现象（Avila等人，2025）。因此，控制假单胞菌带来的腐败风险一直是乳品行业研究人员的重点关注方向。
历史上，开发用于检测乳制品中假单胞菌的方法一直是预防和控制相关风险的关键手段（Bu等人，2022）。不过早期的研究主要依靠物种水平鉴定来进行危害评估和监测，检测方法通常是以乳制品中常见的主要腐败菌荧光假单胞菌为基准开发的（Xin等人，2017）。随着分子生态学研究的进展，人们发现不同的假单胞菌物种（如隆德假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌）常常共同存在于乳品环境中（Du等人，2022）。由于这些细菌都具有引发腐败的潜力，仅依靠物种区分已不够准确。后续研究指出，aprX基因（编码一种保守的碱金属蛋白酶）及其相关的操纵子才是假单胞菌造成腐败的关键因素（Zhang等人，2019）。因此，检测aprX基因的存在便成为评估生奶腐败潜力的常用分子方法（Zhang等人，2025）。然而这种方法也存在明显局限性。包括我们的初步研究在内的多项研究表明，携带aprX基因的菌株之间，其蛋白酶活性和实际腐败潜力存在很大差异（Caldera等人，2016）。Maier等人（2020）通过分析aprX操纵子的遗传结构，发现了操纵子类型与腐败潜力之间的关联。在此基础上，Aguilera-Toro等人（2023）进一步分析了aprX操纵子内的基因序列，揭示了高腐败倾向细菌的遗传特征，同时证明AprX蛋白酶的序列变异会直接影响腐败潜力，不同序列分组在蛋白水解活性上表现为A1＞A2＞B＞N的顺序。这些研究结果表明，决定腐败潜力的并非仅仅是有无aprX基因，而是该基因编码序列中关键位置的细微变异。这些细微差异——即单核苷酸多态性——可以通过改变特定位置的氨基酸残基，显著影响酶的结构、底物结合亲和力以及催化效率（Qiao等人，2019）。不过，从特定的SNP到氨基酸变异，最终再到腐败表型的精确调控，这一完整的机制链目前仍不清楚。这一缺失的机制使得我们无法找到高分辨率的分子靶标，难以有效区分高腐败倾向和低腐败倾向的菌株，进而阻碍了风险评估技术向更高预测精度的发展。
传统的生化实验很难系统地分析众多SNP的功能影响。而计算结构生物学领域的最新突破为这一问题提供了有力工具。例如ColabFold（与AlphaFold2整合）这类工具，仅凭氨基酸序列就能高精度预测蛋白质的三维结构，这为无需晶体结构即可快速获得野生型和突变型AprX模型奠定了基础（Mirdita等人，2022）。结合分子对接技术，就可以定量模拟并比较不同突变型蛋白酶与底物（如κ-酪蛋白）之间的结合自由能以及原子级别的相互作用细节，从而将序列变异直接与原子层面的功能差异联系起来（Wong等人，2022）。
具体而言，从操纵子水平的结构变异到SNP水平的功能差异，是目前知识体系中的一个重要空白，因为尚未在原子层面系统地阐明特定核苷酸变化与蛋白酶功能改变之间的机制联系。为填补这一空白，本研究将计算结构生物学方法（ColabFold/AlphaFold2蛋白建模和分子对接）与传统微生物学方法（蛋白酶活性测定、PFGE分型、全基因组测序以及冷藏实验）相结合，系统研究山东省生奶中分离出的不同假单胞菌菌株之间，由于aprX基因序列差异所导致的腐败程度差异，旨在寻找与强腐败表型密切相关的保守分子标记。因此，本研究不仅旨在揭示AprX蛋白酶的序列-结构-功能关系，还为开发用于精准预警乳制品腐败风险的分子检测工具提供了潜在的靶标。
章节节选
细菌的分离与鉴定
根据实际的牛奶生产情况，我们之前从山东省三个主要地区的24家大型奶牛场采集了生奶样本（Liang等人，2025）。对于每家奶牛场，我们通过混合从主储罐中取出的10个200毫升的样本，得到一份混合生奶样本，所有样本都通过冷链运输到实验室以便立即进行处理。我们采用了Meng等人改进的方法从这些样本中分离出假单胞菌。
菌株遗传多样性分析及代表性菌株的选择
在完成分离和鉴定工作后，我们从山东省的生奶中共分离出了57株假单胞菌，其中包括47株隆德假单胞菌和10株荧光假单胞菌。我们对这些假单胞菌株进行了PFGE分型，以评估它们的遗传多样性。通过Dice系数分析发现，这些菌株之间的遗传相似度在89%到100%之间，说明它们来源于亲缘关系非常接近的群体。尽管相似度如此之高，但PFGE
讨论
乳制品的腐败是一个涉及化学和微生物学过程相互作用的复杂现象，而假单胞菌分泌的热稳定性碱金属蛋白酶AprX被认为是导致腐败的关键因素（Bruzaroski等人，2024）。关于假单胞菌引发乳制品腐败的机制，相关研究经历了显著发展，从最初的物种水平鉴定（Reichler等人，2018），到操纵子水平的结构分析（Maier等人，2020），再到近期的
结论
本研究通过整合基因组学方法（全基因组测序和生物信息学分析）、表型组学方法（冷藏条件下的腐败实验）以及计算结构生物学方法（蛋白质建模和分子对接），构建了一个分子模型，阐明了由于关键腐败基因的核苷酸序列差异而导致的假单胞菌腐败变异的分子机制。重要的是，我们突破了以往仅关注“物种”或“基因
声明
伦理审批：本文没有涉及任何作者所进行的、包含人类受试者或动物的研究。
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金的财政支持（项目编号：U22A20541）。
CRediT作者贡献说明
梁丽娇：概念设计、数据整理、正式分析、方法学、资源获取、软件使用、验证、可视化、初稿撰写、审稿与编辑。 王平：概念设计、项目管理、资源获取、软件使用、验证、可视化。 赵晓梅：方法学、软件使用、验证、可视化。 王哲仁：资源获取、软件使用、验证、初稿撰写。 徐贝贝：方法学、软件使用、验证、可视化。 季庆龙：
利益冲突声明
作者声明，就本文讨论的内容而言，他们与任何金融机构均不存在利益冲突。
梁丽娇|王平|赵晓梅|王哲仁|徐贝贝|季庆龙|陈颖|吴迪
浙江大学生物系统工程与食品科学学院，中国杭州，310058
