综述：以PRPP分配为核心的核苷微生物生物制造：代谢工程、AI-DBTL技术以及食品级工业化面临的挑战

《TRENDS IN FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY》：PRPP allocation-centered microbial biomanufacturing of Nucleosides: Metabolic engineering, AI-DBTL, and food-grade industrialization challenges

　　摘要
背景：核苷及其衍生物是维持生理稳态的重要功能性营养素，在免疫调节、肠道健康及抗疲劳方面发挥着关键作用，因此在膳食补充剂和功能性食品中的应用前景广阔。因此，开发高效且环保的微生物生物制造工艺对于满足市场需求至关重要。

范围与方法：本综述系统分析了核苷生物制造领域的最新进展，涵盖了菌株突变、基因组编辑及代谢途径工程等策略。文中详细阐述了嘧啶核苷和嘌呤核苷的细胞内生物合成途径及其关键调控节点，重点介绍了5-磷酸核糖焦磷酸作为前体分配与代谢流控制的核心枢纽。此外还探讨了多尺度代谢工程方法，如前体强化、反馈抑制缓解、降解途径阻断、辅因子平衡以及转运蛋白改造。同时，也研究了人工智能与多组学数据结合在酶理性设计、代谢瓶颈识别及发酵过程控制中的应用。

主要发现与结论：目前，尿苷、胞苷和肌苷的发酵产率分别达到70.3克/升、18.3克/升和25.8克/升，显示出微生物合成的巨大工业潜力。然而，单一点修饰往往会导致系统性失衡，包括氧化还原失衡、代谢负担增加以及放大生产过程中的稳定性下降。将人工智能与自动化生物工厂相结合，可通过设计-构建-测试-学习循环加速菌株迭代和工艺优化，但在核苷生产中的实际可行性仍需通过实验验证和工业化研究来确认。未来的研究有望在动态代谢流调控、PRPP分配工程以及工业级稳定性设计方面取得进一步突破，从而提升功能核苷的生产效率、降低成本并拓展其应用范围。

引言：核苷作为生物体内核酸结构的重要组成部分，是一类通过糖苷键将含氮杂环碱基与β-D-核糖或β-D-脱氧核糖连接而成的糖苷。它们是构成DNA和RNA分子基本结构单元的碱基的化学前体（Suárez-Marina等人，2018）。根据碱基类型，天然核苷包括胞苷、鸟苷、尿苷、腺苷和胸苷（Ni等人，2019）。这些核苷会经过磷酸化形成核苷酸，进而聚合形成核酸（图1A）（Walton & Szostak，2017）。多种核苷类似物和衍生物也在细胞代谢和基因表达中发挥重要作用（Dong等人，2015；Iglesias等人，2015；Niu & Tan，2015）（图1A）。除了作为结构单元外，核苷及其衍生物还具有多种生物学功能，例如UDP-葡萄糖参与多糖合成，ATP作为能量载体，CDP-胆碱则参与脂质代谢（Kuznetsov等人，2022；Wegrowski & Pitsillides，2014）。在制药领域之外，核苷还是健康食品的关键原料（图1B–D）（Gene-Morales等人，2025）。嘌呤核苷（如腺苷、鸟苷）被用于膳食补充剂中，以保护心脏和调节能量水平（图1D），而嘧啶核苷（如尿苷、胞苷）则通过磷脂合成和突触可塑性促进认知健康（Musial等人，2025；Wurtman等人，2010）（图1B）。此外，二钠5′-鸟苷酸（5′-GMP-2Na）是一种常见的呈味物质，被用作食品添加剂（Ramesh等人，2025）（图1C）。这些多样的应用凸显了核苷化合物在制药和食品科学领域的巨大价值，也推动了全球范围内对其高效合成方法的持续研究。

本综述需要区分三类不同的化合物。核苷属于糖胺类物质，由核碱基（嘌呤或嘧啶）与核糖或脱氧核糖通过糖苷键连接而成，典型的例子包括胞苷、尿苷、肌苷和腺苷。核苷酸中间体则是核苷的磷酸化衍生物，含有一个或多个磷酸基团，包括胞苷单磷酸、尿苷单磷酸、肌苷单磷酸和鸟苷单磷酸，它们作为核酸合成的单体构建块；而核苷三磷酸（如CTP、GTP和ATP）则因其三磷酸结构而成为高能核苷酸衍生物。值得注意的是，核苷酸和核苷是可以相互转化的：核苷酸可经脱磷酸作用生成核苷，核苷则可通过磷酸化作用形成核苷酸。核苷类似物是指经过化学修饰的核苷，被广泛用作抗病毒或抗癌药物。虽然本综述主要关注核苷作为功能性食品成分的应用，但相关文献也会涉及核苷酸以及某些特定的核苷衍生物，如烟酰胺单核苷酸。之所以纳入这些内容，是因为它们具有相似的生物合成途径、在体内的代谢转化关系，且在营养学研究中也经常被一同讨论。此外，外源性核苷酸在吸收前会在胃肠道中迅速脱磷酸，转化为核苷，正是这些核苷的生物活性带来了所观察到的健康益处（Ding等人，2021）。本综述主要聚焦于天然存在的核苷及其磷酸化衍生物，包括尿苷、胞苷、肌苷、腺苷及其相应的核苷酸中间体，以及具有功能性食品潜力的前体分子，如NMN。

鉴于核苷化合物在基础生物学中的核心地位，开发高效且环保的合成策略已成为化学和合成生物学领域的重要研究方向。目前，核苷的合成主要依赖三种技术路径：化学合成、酶法转化和微生物发酵（图2）。传统的化学合成方法（图2A）通常基于活性功能基团的取代和偶联反应（H. Liu, Ding等人，2025），需要多步的保护和去保护操作，并使用有机溶剂（如DMF）及各种金属催化剂。这种方法不仅反应步骤繁琐、条件苛刻，还会产生副产物并带来试剂毒性问题，从而导致较高的生产成本和严重的环境危害。酶法水解方法（图2B），例如通过核糖核酸酶水解RNA来制备胞苷，在一定程度上提高了反应的特异性并降低了反应条件（K. Li, Wu等人，2025；Motter等人，2024）。然而，这类方法存在底物特异性强、酶稳定性低以及难以回收和重复利用酶的缺陷。此外，它们对原材料的纯度要求很高，给工艺放大和工业化应用带来了挑战。相比之下，微生物发酵技术（图2C）自上世纪出现以来，已发展成为绿色核苷制造最具前景的技术平台。以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为代表的原核细胞工厂，由于其遗传背景清晰、代谢途径明确且易于进行基因操作，已成为构建高效核苷生物合成系统的常用宿主（Dong等人，2025）。尤其是大肠杆菌，凭借其生长速度快、遗传工具成熟以及代谢工程灵活等优点，已被广泛用于多种天然及非天然核苷的大规模生产，展现出巨大的工业应用潜力（Ouyang等人，2025）。

在微生物核苷合成领域，已有大量研究对此进行了系统探索。例如，Fang、Liu等人（2013）通过在解淀粉芽孢杆菌的关键酶CPS上引入定点突变（T941F-T970A-K986I），在摇瓶培养条件下实现了1.96克/升的胞苷产率；Zhu等人（2015）通过敲除cdd、hom、pyrR和nupC-pdp基因并过表达prs、pyrG和pyrH，在枯草芽孢杆菌中获得了1.68克/升的产率。在大肠杆菌系统中，Fang等人（2014a；2014b）通过改造嘧啶途径和戊糖磷酸途径，分别在摇瓶中获得了0.72克/升和0.74克/升的产率。Koo等人（2011）利用PCR技术破坏大肠杆菌中的转录抑制剂purR、PEPA和argR，从而解除对氨甲酰磷酸合成酶（carA/B）的反馈抑制，提高carA基因的表达水平，最终实现了5.2克/升的胸苷产率。类似地，Liao等人（2017）通过构建质粒和优化启动子，在解淀粉芽孢杆菌中将鸟苷的产率提升到了19克/升。此外，K. Yang和Li（2020）系统重构了UMP代谢途径，敲除了降解基因并强化了合成模块，在补料分批发酵条件下将胞苷的产率提高到了7.84克/升。X. Zhang、Liu等人（2024）在5升发酵罐中实现了15.7克/升的产率，而Wu等人（2018）通过对UR 6菌株进行代谢工程改造，在5升生物反应器中获得了高达70.3克/升的尿苷产率，这代表了当前核苷发酵技术的最高水平。这些研究表明，无论是通过传统突变技术还是新型代谢流工程手段，提升核苷的高效生产始终是一个备受关注的研究课题，而且已经取得了显著进展。这些研究也揭示了微生物核苷代谢网络的复杂性以及调控方面的挑战。然而，这些策略尚未能够克服一些系统性限制。例如，增强前体代谢可能会打破能量平衡，而打破反馈抑制往往又会引发新的负面代谢调控。此外，过高的合成能力常常会增加细胞的代谢压力并抑制细胞生长。因此，如何在提升目标化合物产量的同时，维持能量代谢、反馈调控网络以及细胞生理状态的总体平衡，已成为突破核苷合成效率瓶颈的核心难题。

因此，本文系统总结了核苷生物制造的核心策略及最新进展，阐明了构建高产核苷微生物细胞工厂的设计思路。以大肠杆菌作为典型模型系统，分析了其内源核苷合成途径的网络架构和调控逻辑，尤其强调了PRPP作为核心代谢枢纽的作用。基于此，文章进一步探讨了协调前体供应、途径合成和产品输出之间关系的代谢工程策略。为实现整体代谢优化，必须同时考虑多个相互关联的因素，包括碳流分布、氮源供应、ATP和NADPH的平衡、产品外排效率以及细胞生长负担。此外，本文还研究了人工智能和机器学习技术在解析此类复杂系统中的独特价值，以及它们在设计核苷生产细胞工厂中的应用前景。为便于对不同工程策略进行系统、可操作的比较，本文从四个维度对各类策略进行了评估：目标代谢节点（局部单节点、局部多节点或全局网络调控）、机制清晰度（尤其是是否存在明确的因果关系）、实施过程中产生的主要代谢成本（包括生长抑制、中间产物积累和能量失衡），以及最佳应用场景（包括适宜的宿主菌株、目标核苷产品及相应的生产阶段）。本综述采用批判性、框架导向的视角，综合了过去十年间在微生物核苷合成、代谢工程、人工智能以及食品应用等相关领域发表的原创研究和综述文章。证据的综合主要通过主题分析完成，旨在呈现该领域的现有观点及正在进行的争议。希望本研究能为核苷及相关生物活性分子的高效、绿色生物制造提供系统的理论参考和实践指导。

片段概述：
高产核苷生产菌株的工程化策略：构建高产核苷微生物细胞工厂依赖于对菌株遗传背景的系统性改造以及对代谢网络的有针对性调控（Cho等人，2022）。目前的工程化策略可分为两大类：传统的突变育种方法和基于精准基因编辑的现代育种策略（图3）。传统突变育种依靠物理或化学方法……

大肠杆菌中的核苷生物合成途径：大肠杆菌是嘧啶核苷生物制造领域的核心模式生物。尽管其生物合成基因分散在基因组中而非聚集在操纵子中，但这种基因组结构为模块化途径设计和理性调控提供了天然优势（Beckwith等人，1962）。合成生物学和代谢工程的进步进一步巩固了大肠杆菌作为高产核苷生产宿主的地位。该生物体的……

高产核苷生产菌株的生物工程策略：正如大肠杆菌中核苷生物合成途径及其关键调控节点的研究所示，一个核心挑战在于如何将这些知识转化为高效的工程策略，以推动核苷生物制造的发展。虽然已有大量关于改造这些途径的系统性综述（Dai等人，2025；Ouyang等人，2025；X. Zhang, Niu等人，2024），但这些综述缺乏一个整合前体供应、途径优化和产品生产的全面合成生物学框架……

核苷生物制造的智能系统与流程集成：如前所述，传统的筛选和工程化高产核苷生产菌株的方法面临诸多技术障碍。人工智能和机器学习技术的快速发展为建立代谢工程的理论框架并指导实验实践提供了巨大潜力。基于多组学数据训练的机器学习模型可通过模式识别来突破技术瓶颈。在核苷及其相关衍生物在食品应用、安全性以及工业转化方面的应用方面，前文已详细阐述了微生物合成核苷的技术路径与工程策略。然而，要将核苷有效用作功能性食品成分，还有三个方面需要系统探讨：其健康益处与膳食依据、食品级生产及监管要求，以及核苷及其相关衍生物的主要应用场景和工业转化途径。

局限性及未来展望
尽管核苷生物制造领域取得了显著进展，但从分子层面的催化元素到工业化生产流程，整个技术链中仍存在一系列相互关联的根本性限制（见图7A）。这些挑战严重制约了该技术的效率、经济可行性及规模化潜力。最主要的限制在于催化元素的核心性能，其结构稳定性较差。

结论
本综述系统梳理了核苷生物制造从传统菌株工程向智能系统设计的演变历程，得出了一个核心观点：PRPP的分配是连接核苷合成、前体物质竞争以及细胞生长调控的关键节点。虽然嘌呤途径和嘧啶途径都以PRPP作为共同前体，但二者之间的物质流动分布本质上是不平衡的。

作者贡献说明
叶彤：概念设计、研究、软件使用、数据整理、资源获取、初稿撰写。徐俊楠：研究、资源获取、数据整理。魏晓波：研究、数据整理、可视化处理。丁伟：研究、资金申请、项目管理、审稿与编辑。刘慧燕：资源获取、可视化处理、项目管理、定量分析、资金申请、审稿与编辑。方海天：概念设计、方法论设计、写作。

伦理审批声明
本文未涉及任何作者所进行的涉及人类受试者或动物的研究。

资金支持
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号31860020；32560239）、宁夏回族自治区自然科学基金（项目编号2023AAC02030；2026AAC030040；2025AAC030145）、宁夏回族自治区科技创新领军人才培育计划（宁科合字[2025]第9号）、胞苷核苷生物合成技术研究人才计划以及宁夏大学研究生创新项目的支持。

利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何相关利益冲突。

致谢
无。

叶彤|徐俊楠|魏晓波|丁伟|刘慧燕|方海天
中国宁夏银川市宁夏大学生命科学学院，邮编750021