《PLOS Biology》：A single-cell transcriptomic atlas reveals the emergence of medusa-specific cell states in the Aurelia coerulea scyphozoan
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大多数钵水母纲刺胞动物（medusozoan cnidarians）的生命周期以从无性繁殖的固着水螅体（polyp）到有性繁殖的游动水母体（medusa）的交替生殖（metagenesis）为标志。目前，尚不清楚这种剧烈的形态转变在多大程度上伴随着细胞类型组成
大多数钵水母纲刺胞动物（medusozoan cnidarians）的生命周期以从无性繁殖的固着水螅体（polyp）到有性繁殖的游动水母体（medusa）的交替生殖（metagenesis）为标志。目前，尚不清楚这种剧烈的形态转变在多大程度上伴随着细胞类型组成的分子变化。本研究提供了全球分布广泛的钵水母纲物种海月水母（Aurelia coerulea）的单细胞转录组图谱，重点关注从水螅体到水母体转变过程中单个细胞状态的变化。值得注意的是，这种转变以细胞类型多样性的增加为特征，包括神经亚型（neural subtypes）的扩展和横纹肌（striated muscles）的出现。研究人员发现，海葵（Nematostella vectensis）和海月水母中由同源转录因子（transcription factors）指定的两个神经元谱系家族，表明其起源可追溯到约5亿年前钵水母纲和珊瑚纲（anthozoans）的共同祖先。分析表明，基因重复（gene duplications）可能是刺胞动物神经腺体谱系（neuroglandular lineages）进化过程中细胞复杂性增加的驱动因素，并强调了神经元与肌肉之间的密切关系。一个关键的钵水母纲特异性细胞类型是下伞面（subumbrella）的横纹肌。通过纤维解剖学评估肌肉类型以及对其个体分子谱进行基因表达验证，首次使得研究平滑肌（smooth muscles）和横纹肌之间的转录组差异成为可能。尽管平滑肌和横纹肌在表型上不同，但两者均具有相似的收缩复合体（contractile complex）调控机制，这让人联想到两侧对称动物（bilaterians）中平滑肌的调控。这与两侧对称动物的横纹肌形成对比，后者肌肉收缩的调控涉及Ca2+结合肌钙蛋白（troponins）及其与原肌球蛋白（Tropomyosin）的相互作用。这些数据表明，平滑肌收缩调控是祖先性的，而横纹肌中肌钙蛋白的使用仅在两侧对称动物中进化而来。
**论文解读：单细胞转录组图谱揭示海月水母水母体特异性细胞状态的出现**
**研究背景与问题**
刺胞动物（Cnidaria）是两侧对称动物（Bilateria）的姊妹群，其细胞类型多样性的进化机制是理解动物复杂身体计划起源的关键。大多数钵水母纲（Medusozoa）刺胞动物具有三相生命周期：自由游泳的幼虫、无性繁殖的水螅体（polyp）和有性繁殖的水母体（medusa）。而珊瑚纲（Anthozoa，如海葵）则缺乏水母体阶段。从固着的水螅体到游动的水母体的转变（称为交替生殖，metagenesis）伴随着剧烈的形态重组，并伴随着水母体特异性细胞类型的出现（如横纹肌和特定的神经元）。然而，此前的研究主要通过批量转录组测序表征了不同生命阶段的基因表达变化，但尚未在单细胞水平上解析这一转变过程中细胞类型组成的分子变化。因此，研究人员旨在通过构建海月水母（Aurelia coerulea，一种钵水母纲模式物种）的单细胞转录组图谱，系统揭示从水螅体到水母体转变过程中细胞状态的动态变化，并探究水母体特异性细胞类型（如横纹肌和神经亚型）的分子特征及其进化起源。该研究发表在《PLOS Biology》。
**主要技术方法**
研究人员利用10x Genomics平台对海月水母不同生命阶段（水螅体、四叶草期水螅体、早期和晚期横裂体、碟状体、幼龄水母体）以及水母体不同组织（伞部、边缘、口腕、胃皮）制备了16个单细胞RNA测序（scRNA-seq）文库。所有样本来源于实验室饲养超过25年的海月水母品系（经CO1基因鉴定为A. coerulea）。测序数据映射至A. coerulea参考基因组（NCBIGCA_039566865.1），并使用AUGUSTUS进行基因预测。通过Seurat包进行数据整合、聚类和差异表达分析，识别细胞类型和状态。此外，研究人员还进行了免疫组化（抗β-微管蛋白和抗FMRFamide抗体）和鬼笔环肽染色，以验证神经和肌肉的解剖结构，并通过原位杂交（WMISH）验证标记基因的表达。为了比较不同物种，使用OMA鉴定了A. coerulea与海葵（Nematostella vectensis）之间的1:1直系同源基因，并利用Harmony算法整合了两者的刺胞细胞和神经细胞数据。
**研究结果**
**1. 过渡到自由游泳的水母体伴随细胞类型组成的增加**
通过比较不同生命阶段的基因检测数，发现水螅体样本中表达的基因数量比水母体阶段低约10%，约6%的编码基因组仅在水母体阶段激活，这些基因富集于信号传导和离子通道，提示水母体神经元多样性增加。研究人员还鉴定出49个水母体特异性表达基因，包括5个视紫红质样GPCR基因和1个横纹肌型肌球蛋白重链（stMyHC-5）。整体上，主细胞群包括刺胞细胞、神经元、消化腺、粘液腺、横纹肌、内上皮（胃皮）和外上皮（表皮）以及一个未表征的细胞群，其中横纹肌是唯一在水螅体样本中缺失的主细胞群。
**2. 刺胞细胞揭示珊瑚纲和钵水母纲之间刺胞发生的保守特征**
刺胞细胞（cnidocytes）显示出与海葵相似的“分叉”分化轨迹：早期SoxC阳性细胞沿两条主要轨迹分化（cnido.1和cnido.2），随后在jun/fos激活后汇聚为成熟表型。通过整合海葵的刺胞细胞数据，发现早期和晚期刺胞细胞状态在两种物种中聚类在一起，而亚型分化路径中，A. coerulea的cnido.1和海葵的nem.1可能代表共同拥有的等丝囊（isorhiza）类型。转录因子表达时序分析表明，刺胞细胞发育的总体遗传轨迹在两种物种中保守，包括早期表达myc、soxC、prdm13a和ZN431-like-1，晚期表达paxA、JUN/FOS和gfi1b。
**3. 海月水母神经细胞组成揭示两类神经分泌细胞，与珊瑚纲神经腺体群体具有相似性**
海月水母的神经细胞可分为两类：1类神经元（class 1）表达胰岛素瘤（ins1）阳性，2类神经元（class 2）表达pou4/brn3和ashA。1类神经元在水螅体阶段占主导，包括多个亚型（如表达LWamide、乙酰胆碱受体等），并包含非神经分泌细胞（s1）。2类神经元在水母体伞部和边缘样本中丰富，包括5个首先在横裂体或碟状体阶段出现的神经元簇（n2.7.m至n2.10.e）。2类神经元表达特异性α-和β-微管蛋白，抗β-微管蛋白抗体标记MNN（运动神经网），而FMRFamide抗体标记DNN（弥散神经网），尽管两者均属于2类神经元，但显示不同亚型定位。
**4. 肌肉谱系对应于平滑肌和横纹肌纤维类型**
横纹肌是水母体特异性细胞类型，其分子特征富集肌球蛋白、肌动蛋白等结构基因，并表达特异性转录因子如bHLH家族（cPATH样）、otx1a和otx2。鬼笔环肽染色显示水螅体具有三种平滑肌区域（口盘放射肌、触手纵肌、体柱缩肌），而横纹肌在碟状体阶段出现于冠状和放射方向。通过原位杂交验证，calponin1特异性标记水螅体缩肌，mrlc2标记所有平滑肌，stmyhc1在平滑肌和横纹肌中均有表达，而stmyhc5仅限于晚期碟状体横纹肌，提示其可能为水母体快速收缩横纹肌的特异性标志物。
**5. 横纹肌在从水螅体到水母体的交替生殖中出现**
横纹肌在横裂体阶段开始出现，研究人员发现stmyhc1在早期发育的横纹肌和残留的水螅体缩肌中均有表达，而stmyhc5仅在成熟横纹肌中表达。mrlc2在两种肌肉亚型中共享，提示横纹肌可能起源于平滑肌前体状态。
**6. 肌肉收缩的原理及旁系同源物的亚功能化**
两种肌肉亚型均表达核心祖先收缩复合体基因，包括钙调蛋白、肌球蛋白轻链激酶（mylk）、原肌球蛋白（tpm）及肌球蛋白重链、必需轻链和调节轻链。与脊椎动物不同，刺胞动物缺乏真正的肌钙蛋白同源物，因此收缩调控依赖于MYLK和肌球蛋白轻链磷酸化，这与两侧对称动物的平滑肌调控机制相似。几乎所有核心收缩蛋白基因都经历了多次基因重复，旁系同源物在平滑肌和横纹肌中差异表达，表明亚功能化过程。例如，肌球蛋白必需轻链的四个旁系同源物中，两个在平滑肌中表达，两个在横纹肌中表达。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，单细胞转录组图谱揭示了水母体形成过程中细胞类型多样性的增加，尤其是神经元亚型的扩展和横纹肌的出现。与海葵的比较表明，刺胞细胞发育的基因调控在钵水母纲和珊瑚纲之间高度保守，而神经细胞的两类划分（ins1阳性和pou4阳性）在两种刺胞动物中相似，但水螅体阶段主要为1类神经元，而水母体阶段2类神经元增多。转录因子家族（如ATOH8、myc）的扩展可能与水母体特异性细胞类型的产生相关。对于肌肉，平滑肌和横纹肌共享核心收缩装置，但横纹肌中缺乏肌钙蛋白，提示其收缩调控机制与两侧对称动物的平滑肌类似，而横纹肌肌钙蛋白系统仅在两侧对称动物中进化。
结论部分总结：本研究旨在鉴定钵水母纲水母体细胞类型的转录组特征，并表征从固着水螅体到自由游泳水母体这一生命史转变（称为横裂）相关的分子变化。这种转变重塑了水母体细胞状态的组成和身份，分析强调了关键发育和生理创新在这一转变中涌现。通过建立海月水母的参考细胞图谱，为刺胞动物学界以及发育和进化生物学家提供了研究水母体生物学基本方面的资源，包括产生水母体特异性细胞状态的发育途径、这些状态的进化起源以及它们在动物细胞类型中的系统发育关系。预期该图谱将作为比较分析的基础，使研究人员能够探索水母体性状在动物界中如何出现、多样化并可能进化。
