穿膜肽：机制景观、测定方法和应用

《Chemical Reviews》：Membrane-Traversing Peptides: Mechanistic Landscapes, Assays, and Applications

　　

脂双层膜是细胞必不可少的选择性通透屏障，严格限制极性分子和大分子的通过，从而分隔细胞生化反应并限制治疗药物可及的化学空间。穿膜肽（MTPs）是一类多样化的肽，其定义是能够穿越合成膜或细胞膜而不引起通透化，且不依赖特定转运蛋白的协助。这些肽从根本上违背了经典的膜通透性热力学模型，因为它们能够跨越脂双层并将大的极性货物（包括肽和蛋白质）递送入细胞，尽管它们具有高净电荷和低疏水性。在本综述中，研究人员挑战了用单一离散机制来描述肽如何穿越膜的观点，并定义了一个由MTPs的保守特性以及脂双层的独特物理化学和多晶相行为塑造的广泛机制景观。研究人员描述了可用于研究MTPs在合成系统和活细胞中转位及货物递送的实验测定方法和模型系统。研究人员利用从综合数据库获得的信息来考虑MTPs共享的物理化学空间。研究人员还讨论了关于机制、特异性、内体逃逸和体内性能的关键未解问题。最后，研究人员讨论了MTPs在细胞内药物递送和分子治疗中的示例性例子和新兴转化应用。总之，这些观点强调了MTPs作为细胞膜基础生物物理研究的探针和作为扩展可成药细胞内靶标宇宙的有前景工具的双重重要性。

**论文解读：《穿膜肽：机制景观、测定方法和应用》**

**研究背景与问题**

脂双层膜是细胞必需的渗透屏障，严格限制极性分子和大分子的自由扩散，从而将细胞生化反应分隔为不同区室，并极大限制了可靶向细胞内蛋白的药物化学空间。传统小分子药物依赖被动扩散穿过膜，其通透性由烃类溶解度决定，但穿膜肽（MTPs）却完全违背了这一经典模型：它们具有高净电荷和低疏水性，却能穿越膜并递送大分子极性货物（如肽、蛋白质、核酸）。尽管已有大量细胞穿透肽（CPPs）的研究，但“CPP”一词已不足以涵盖这些肽的多样性。更重要的是，MTPs的跨膜机制尚未统一，存在多种相互矛盾的假设，且缺乏系统性描述框架。此外，低内体逃逸效率、靶向特异性不足、体内生物利用度低及毒性等问题，严重阻碍了MTPs的临床转化。因此，需建立统一的机制景观，全面总结现有测定方法，并分析MTPs的物理化学性质，以推动其基础研究和应用发展。

**研究内容与结论**

本文以《Chemical Reviews》期刊发表，研究人员系统综述了MTPs的机制景观、实验测定方法、物理化学性质、数据库分析、机器学习预测及代表性示例。研究人员提出“机制景观”概念，用“维度”（二维/三维）和“各向异性”（各向异性/各向同性）两个正交轴描述MTPs跨膜时速率限制中间体的结构。MTPs可通过单体直接转位、诱导膜曲率、形成多层膜囊泡或非双层结构等多种途径穿越膜，且这些途径通常共存并依赖于膜脂的多晶相行为。研究人员基于CPPsite3数据库（包含>7000个序列）分析发现，绝大多数MTPs为线性阳离子肽，精氨酸含量远高于赖氨酸，中位净电荷约+6，疏水性极低，这表明静电相互作用而非疏水效应是驱动膜结合与转位的主要动力。机器学习（如随机森林、深度学习）已能有效预测MTPs活性。研究人员还总结了多种测定方法，涵盖合成膜系统（大型单层囊泡、巨型单层囊泡、多层囊泡、平行人工膜渗透性测定）和活细胞系统（共聚焦显微镜、荧光素酶剪接校正、Cre重组酶、HaloTag、NanoClick、SNAP-tag等），以及原核细胞中的HaloTag和SLALOM等方法。最后，研究人员讨论了MTPs在细胞内药物递送中的关键挑战（低内体逃逸、靶向性、毒性等），并列举了代表性示例（自发膜转位肽SMTPs、钉书肽、经典CPP如TAT、PepFect家族、膜耦合点状物MCP、液-液相分离介导递送等）。

**主要技术方法**

研究人员主要采用以下关键技术方法：1）合成膜系统：大型单层囊泡（LUV）转位测定（利用蛋白酶保护、荧光淬灭、超分子宿主-染料对等方法）、巨型单层囊泡（GUV）和多层囊泡（MLV）的共聚焦显微镜成像、平行人工膜渗透性测定（PAMPA）。2）真核细胞系统：共聚焦显微镜（活细胞成像、点状物观察）、细胞存活/凋亡测定（如KLA肽递送）、SLEEQ/SEE/分裂GFP互补测定、荧光素酶剪接校正测定（HeLa pLuc/705细胞系）、GIGI/GIGT测定（基于糖皮质激素受体）、Cre重组酶测定（loxP-STOP-loxP报告细胞）、CAPA/HaloTag测定、NanoClick测定（NanoBRET）、SNAP-tag测定（Cyto-SNAP和SNAP-switch）、Transwell单层细胞通透性测定（MDCK细胞、Caco-2细胞）。3）原核细胞系统：流式细胞术、荧光显微镜（包括细菌原生质球）、FRET、透射电镜（纳米金标记）、HaloTag测定（大肠杆菌E. coli）、SLALOM（分裂荧光素酶）、反义PNA功能测定。4）数据库与机器学习：基于CPPsite3数据库（>7000条序列）的统计分析，以及随机森林、深度学习（如AiCPP、LightCPPgen）等预测方法。

**研究结果**

**1. 脂双层的物理化学与多晶相行为**：通过分析磷脂分子准分子基团数密度分布，研究人员指出膜界面存在极性梯度，且脂质具有多晶相行为（可形成非双层结构如六角相、立方相），这些特性为MTPs的跨膜提供了结构基础。

**2. 肽-膜相互作用的基本原理**：MTPs主要依靠疏水效应和静电作用结合膜。研究人员通过Wimley-White界面疏水刻度和辛醇-水分配系数（log P）比较发现，MTPs的log P值远超出小分子药物的被动扩散窗口（1-4），说明其跨膜并非依赖平衡溶解度-扩散机制。

**3. 机制景观**：研究人员提出用“维度”和“各向异性”两个轴描述机制景观。左上象限（二维各向异性）：肽以单体或少数分子协同作用，保持双层片层结构，如自发膜转位肽SMTPs（TP1、TP2、TP3）通过精氨酸与脂质磷酸盐的“跳跃”机制转位。右上象限（二维局部非双层）：肽诱导局部非双层结构（如环状孔、倒胶束），降低跨膜能垒，如某些阳离子肽形成曲率丰富区域。左下象限（三维多层膜）：肽-脂质形成多层膜囊泡或芽生结构，使货物随水相内化，如Pei等人描述的“囊泡芽生与塌陷”机制。右下象限（三维非双层）：肽-脂质形成大尺寸各向同性非双层颗粒，可能涉及内体逃逸。研究人员通过共聚焦显微镜观察到P17肽在10秒内形成膜耦合点状物（MCP），随后快速进入胞质，支持三维机制。

**4. 技术方法与测定**：系统总结了合成膜和细胞膜中的多种测定方法。例如，Marks等人开发的正交荧光测定法可同时测量转位和通透化，筛选出SMTPs；Hennig等人利用超分子宿主-染料对实现无标记转位监测；SLEEQ测定通过HiBiT-LgBiT互补定量内体逃逸效率；SLALOM通过分裂荧光素酶检测肽穿越大肠杆菌外膜。

**5. MTPs的性质**：基于CPPsite3数据库，研究人员发现MTPs中91%为线性肽，77%为L-氨基酸，长度中位数约15个残基，精氨酸丰度是人蛋白质组的4倍，赖氨酸为2倍。大多数MTPs净电荷为+6至+9，且界面疏水结合能（ΔG_interface）很少达到-4 kcal/mol，表明静电吸引是主要驱动力。

**6. 代表性示例**：SMTPs（如TP1-TP3）可在低浓度下直接穿越纯磷脂双层且不引起通透化；钉书肽（如BH3螺旋）通过烃链钉书稳定α-螺旋，提高膜转位和靶标亲和力；经典CPP（如TAT、Arg9）依赖内吞或直接转位，用于反义寡核苷酸递送；PepFect家族通过N端硬脂酸修饰和与货物的非共价组装，实现高效内体逃逸；MCP介导的递送（如P17）在数秒内形成膜相关点状物，将货物快速释放到胞质；液-液相分离（如L17E三聚体与IgG形成共凝聚物）提供了一种新的蛋白质递送方式。

**总结与讨论**

研究人员在结论部分指出，MTPs已发展为递送小分子、核酸、蛋白质、纳米颗粒和基因组编辑复合物的工具。其多样化的类别、摄取机制、设计策略和研究方法揭示了与细胞和膜相互作用的复杂性。然而，仍存在大量未解问题，包括决定直接转位与内吞摄取的确切分子决定因素、机制在不同细胞类型和生理条件下的变化程度、货物如何影响细胞内运输和命运。此外，实现可预测的靶向性、内体逃逸、最小化脱靶效应和毒性，以及将体外功效转化为体内和医学相关应用，仍是持续挑战。解决这些差距需要肽工程、定量生物物理、测定方法和成像技术的持续进步。随着这些努力汇聚，MTPs有望在基础研究、诊断和治疗中发挥日益变革性的作用，前提是更深入的机制理解指导其合理设计和应用。