利用冷冻电镜与电荷检测质谱技术解析细菌蛋白酶体激活因子（Bpa）-底物复合物中的隐含化学计量关系

《Journal of the American Chemical Society》：Resolving Hidden Stoichiometries in Bacterial Proteasome Activator (Bpa)-Substrate Complexes by Cryo-EM and Charge Detection Mass Spectrometry

　　

摘要

细菌蛋白酶体激活因子（Bpa）是结核分枝杆菌蛋白酶体系统中的调控蛋白，它能促进无需ATP的底物结合，并将其送至20S核心颗粒进行降解。目前研究最透彻的Bpa底物是HspR，这是一种负责调控Mt应激反应基因的转录抑制剂，其通过Bpa的降解作用才能维持病原体的毒力。不过，Bpa与HspR之间的化学计量比、底物结合的分子机制以及由此形成的复合体的异质性仍不清楚。在本研究中，我们结合电荷检测质谱法和单粒子电子冷冻显微镜技术，分别对无配体状态的Bpa以及与HspR结合后的Bpa进行了研究。电荷检测质谱法发现了一种此前未被报道的十一聚体无配体状态Bpa，同时确定了Bpa₁₂:HspR₂的稳定化学计量比，且该比例几乎不存在异质性。而无需使用交联试剂的电子冷冻显微镜技术也独立证实了溶液中存在十一聚体形式的Bpa，并将底物相关的密度区域定位在Bpa的C端H4螺旋上。这两种互补的单粒子分析方法为未来针对结核分枝杆菌蛋白酶体系统开展研究提供了依据，同时也为理解原核生物中蛋白酶体对底物的识别机制带来了新的见解。