十二指肠贾第鞭毛虫和内阿米巴属：埃及农场动物的粪便学与基于抗体的检测方法

《BMC Veterinary Research》：Giardia duodenalis and Entamoeba spp.: Coprological and antibody–based approaches across farm animals in Egypt

　　

十二指肠贾第鞭毛虫（Giardia duodenalis，同义名G. lamblia、G. intestinalis）和内阿米巴属（Entamoeba spp.）是引起全球人类和动物胃肠道疾病的肠道原虫。本研究旨在确定埃及农场动物中贾第虫（Giardia）和内阿米巴（Entamoeba）感染的流行率，并开发一种内部夹心ELISA（sandwich ELISA）用于其粪抗原（coproantigen）检测。本研究共收集了来自五个省份不同年龄组的水牛（N=875）、牛（N=770）、绵羊（N=520）和山羊（N=509）的2674份粪便样本。所有样本均采用常规显微镜检查方法。显微镜检查结果显示，贾第虫和内阿米巴感染分别检出626/2674（23.4%）和457/2674（17.1%），其中绵羊的两种寄生虫感染率最高（贾第虫44.6%，内阿米巴28.8%）。选取代表性分离株进行分子鉴定，以在抗原制备前确认寄生虫身份，靶向β-giardin（bg）基因和小亚基核糖体RNA（ssu rRNA）基因，确认了十二指肠贾第鞭毛虫（GenBank: OQ388331.1, OQ388332.1, OR029977.1, OR029976.1, OR029974.1, OR029975.1和PP316110.1）和溶组织内阿米巴（E. histolytica）（GenBank: OR016432.1）的存在。分别从这些分离株制备抗原，并在兔中制备多克隆抗体（pAbs），使用Protein-A-Sepharose亲和层析柱纯化。然后，将抗贾第虫IgG pAbs和抗内阿米巴IgG pAbs内部夹心ELISA分别对所有粪便样本进行检测，结果显示贾第虫属（Giardia sp.）感染率为45.2%（1208/2674），内阿米巴属（Entamoeba sp.）感染率为30.1%（805/2674），与显微镜检查相比，检测贾第虫（χ²=281.2，p<0.001）和内阿米巴（χ²=125.6，p<0.001）的能力较高。总之，本研究开发的夹心ELISA是一种灵敏可靠的检测农场动物贾第虫和内阿米巴感染的诊断工具。将其应用于常规监测，并结合补充性分子确认，有助于提高流行病学准确性并评估人畜共患风险。

**论文解读：十二指肠贾第鞭毛虫与内阿米巴属在埃及农场动物中的粪便学与基于抗体的检测方法研究**

**研究背景与问题**

由十二指肠贾第鞭毛虫（*Giardia duodenalis*）和内阿米巴属（*Entamoeba* spp.）引起的肠道原虫感染在兽医领域具有重要影响。这些寄生虫在农场动物（包括水牛、牛、绵羊和山羊）中广泛分布，通过摄入污染饲料、水或环境中的感染性包囊传播，导致腹泻、营养吸收障碍、体重下降和生产力损失，造成显著的经济损失。此外，*G. duodenalis*的人畜共患基因型（如Assemblage A和B）在埃及的循环进一步强化了其“One-Health”框架下的重要性。同样，内阿米巴感染在农场动物中常见，但多数为无症状携带，而溶组织内阿米巴（*E. histolytica*）在特定条件下可引起肠道紊乱。当前，诊断主要依赖粪便显微镜检查，该方法虽成本低、操作简单，但敏感性有限，尤其是在虫体间歇性排出或低感染强度时，易漏诊。因此，需要开发更灵敏、可靠的诊断工具，以准确评估流行率、监测人畜共患风险并指导防控策略。本研究旨在评估一种内部开发的夹心ELISA（sandwich ELISA）在检测农场动物粪便中贾第虫和内阿米巴抗原的性能，并与显微镜检查进行比较。

**主要技术方法**

研究人员于2023年1月至2024年12月，在埃及开罗、吉萨、卡夫尔谢赫、贝海拉和盖勒尤卜五个省份，从水牛（N=875）、牛（N=770）、绵羊（N=520）和山羊（N=509）的直肠采集2674份粪便样本，涵盖不同年龄组（幼龄和成年）。所有样本首先进行常规显微镜检查（直接湿涂片、改良Ziehl-Neelsen染色、沉淀和漂浮法）以检测寄生虫包囊、卵囊、滋养体和幼虫。选取显微镜阳性且虫体丰富的代表性样本，通过PCR靶向β-giardin（*bg*）基因（贾第虫）和小亚基核糖体RNA（*ssu rRNA*）基因（内阿米巴）进行分子鉴定，并通过测序和系统发育分析确认虫种及基因型。随后，从阳性粪便中分离*G. duodenalis*和*E. histolytica*包囊，制备粗抗原（CGAg和CEAg），免疫新西兰白兔制备多克隆抗体（pAbs），经Protein-A-Sepharose亲和层析柱纯化，并标记辣根过氧化物酶（HRP）。建立内部夹心ELISA，通过棋盘滴定确定最佳包被抗体和HRP结合抗体浓度，以健康动物粪便样本确定cut-off值（均值+3倍标准差），并评估其诊断性能（灵敏度、特异性、阳性预测值PPV、阴性预测值NPV、诊断效率DE、ROC曲线下面积AUC），同时检测其他常见胃肠道寄生虫（如隐孢子虫、片形吸虫、类圆线虫、艾美耳球虫）感染样本以评估交叉反应性。

**研究结果**

**寄生虫学检查**
显微镜检查显示，贾第虫总体感染率为23.4%（626/2674），内阿米巴为17.1%（457/2674）。绵羊感染率最高（贾第虫44.6%，内阿米巴28.8%），其次为山羊、牛和水牛。年龄相关趋势显著：贾第虫、内阿米巴、隐孢子虫和艾美耳球虫在6月龄以下幼龄动物中更常见，而片形吸虫和类圆线虫在成年动物中更常见（p<0.05）。混合感染（两种及以上寄生虫）检出率为22.8%（610/2674）。

**系统发育分析与分子鉴定**
通过*bg*基因测序，7个*G. duodenalis*分离株（GenBank: OQ388331.1等）均聚类于人畜共患的Assemblage A，与埃及人源和动物源序列高度相似，部分牛和山羊分离株属于Assemblage B。*Entamoeba*分离株（OR016432.1）经*ssu rRNA*基因确认属于*E. histolytica*，与参考序列聚类一致。

**蛋白含量与免疫应答**
CGAg和CEAg蛋白含量分别为5 mg/mL和6 mg/mL。纯化后抗贾第虫IgG pAbs和抗内阿米巴IgG pAbs蛋白浓度分别为4.5 mg/mL和3 mg/mL。间接ELISA显示，免疫后兔血清抗体效价在第1次加强免疫后1周开始升高，最终OD值分别达3.158±0.102和3.375±0.151（1/100稀释）。

**夹心ELISA的免疫诊断性能**
抗贾第虫夹心ELISA的cut-off值为0.384，阳性样本平均OD为2.081±1.004，灵敏度96.7%，特异性98.09%，PPV 93.5%，NPV 94.44%，交叉反应率2.4%，诊断效率97.8%，ROC AUC为0.974。抗内阿米巴夹心ELISA的cut-off值为0.429，阳性样本平均OD为1.650±1.005，灵敏度95.8%，特异性97.1%，PPV 88.5%，NPV 99.03%，交叉反应率3.6%，诊断效率96.89%，ROC AUC为0.965。两种检测对隐孢子虫、片形吸虫、类圆线虫和艾美耳球虫等常见寄生虫的交叉反应性极低。

**夹心ELISA检测农场动物粪便抗原**
使用夹心ELISA检测所有2674份样本，贾第虫感染率为45.2%（1208/2674），其中绵羊68.1%、山羊63.3%、牛39.4%、水牛26.2%；内阿米巴感染率为30.1%（805/2674），其中绵羊47.9%、山羊37.3%、水牛24.8%、牛19.4%。与显微镜检查相比，夹心ELISA显著提高了检出率，贾第虫（χ²=281.2，p<0.001）和内阿米巴（χ²=125.6，p<0.001）的差异具有统计学意义。

**总结与讨论**

研究人员指出，显微镜检查可能低估了贾第虫和内阿米巴的真实感染率，尤其是在亚临床或低强度感染时。夹心ELISA通过检测可溶性粪抗原，不受包囊完整性或间歇性排出的影响，表现出更高的灵敏度和特异性。系统发育分析显示，所有*G. duodenalis*分离株属于人畜共患的Assemblage A和B，且与埃及人源序列高度相似，提示共同的环境污染或跨物种传播；*E. histolytica*的确认也支持其潜在人畜共患风险。但研究也强调，由于仅对有限的代表性分离株进行了测序，系统发育结果不能代表全部遗传多样性，未来需更大规模测序。此外，多克隆抗体可能引入批次变异，建议未来研究采用单克隆抗体以提高标准化和特异性。尽管夹心ELISA表现出色，但其阳性结果仍需分子确认以排除假阳性，尤其是在评估人畜共患风险时。

**结论**
从One-Health视角出发，本研究揭示的农场动物中贾第虫和内阿米巴高感染率，凸显了其作为人畜共患传播潜在储库的重要作用。本研究支持将开发的夹心ELISA作为敏感的诊断工具，用于检测农场动物中的贾第虫和内阿米巴感染。建议将该抗原检测方法整合到常规诊断规程中，以提高准确性，并结合补充性分子检测以确认物种身份并评估人畜共患风险。