解决FSfaCV/PCV5相关病毒在Macochavirus属中的系统发育位置

《Transboundary and Emerging Diseases》：Resolving the Phylogenetic Placement of the FSfaCV/PCV5-Related Viruses Within the Genus Macochavirus

　　

对中国腹泻猪的粪便样本进行宏基因组学分析，鉴定出10个完整的环状单链DNA病毒基因组，此前被命名为推定的猪圆环病毒5（PCV5）样病毒。基因组特征揭示了一个典型的cressdnavirus组织，具有双向取向的Rep（复制相关蛋白）和Cap（衣壳蛋白）基因。基于完整基因组和编码蛋白的系统发育分析表明，这些病毒不与圆环病毒科（Circoviridae）成员聚类，而是在豌豆病毒科（Pecoviridae）内形成一个独特谱系，与Macochavirus属密切相关。序列同一性、遗传距离和核苷酸多样性分析支持将它们分类为一个连贯的病毒组。比较分析表明，Rep区域的序列差异大于Cap区域。这些发现支持将推定的PCV5重新分类为Macochavirus属内的一个猪相关谱系，命名为猪Macochavirus（porcine Macochavirus, PMV），从而解决了其长期存在的分类学模糊性，并扩展了Pecoviridae科内cressdnaviruses的已知多样性。

**论文解读：解决FSfaCV/PCV5相关病毒在Macochavirus属中的系统发育位置**

**研究背景与问题**
高通量宏基因组测序技术极大推动了病毒发现，尤其是对环状复制相关蛋白编码单链DNA病毒（cressdnaviruses）的鉴定。cressdnaviruses是一类高度多样的小型环状DNA病毒，通常编码保守的Rep蛋白和Cap蛋白，广泛存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物及环境样本中。在猪中，已鉴定出多种cressdnaviruses，其中猪圆环病毒（PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae），包括PCV1至PCV4。PCV2是公认的病原体，与猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）密切相关。然而，通过宏基因组学发现的另一类病毒——暂定名为猪圆环病毒5（PCV5）样病毒，其进化起源和分类位置长期不明确。系统发育分析表明，PCV5与海狗粪便相关环状DNA病毒（FSfaCV）更接近，而非经典圆环病毒，提示这些病毒可能代表不同于Circoviridae的cressdnavirus谱系。但由于注释参考基因组有限且缺乏明确的分类框架，FSfaCV/PCV5相关病毒的分类学地位一直悬而未决。此外，基于单基因的系统发育分析常产生不一致或弱支持的进化信号。因此，需要整合多种证据以准确解析其进化关系和分类位置。

**研究内容与结论**
本研究通过对中国腹泻猪粪便样本进行宏基因组测序，鉴定出10个完整的环状单链DNA病毒基因组。通过基因组特征分析、系统发育重建、序列同一性和遗传距离分析、单倍型网络推断以及全基因组核苷酸多样性分析，研究人员证明这些病毒并非Circoviridae成员，而是属于豌豆病毒科（Pecoviridae），并与Macochavirus属进化关系密切。具体而言，基于完整基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的系统发育树均显示，新鉴定的10个基因组与先前报道的FSfaCV/PCV5相关序列聚类形成一个独立谱系，且该谱系嵌入Macochavirus属的多样性内，而非构成独立属。序列同一性分析显示，这些病毒之间核苷酸同一性≥87%，与Macochavirus uywa参考序列的同一性为76.3%–80.0%，与其他属的同一性低于56.1%，遗传距离分析也支持这一分类。单倍型网络和核苷酸多样性滑动窗口分析进一步证实了该谱系与Macochavirus属的紧密关系。基于这些证据，研究人员将FSfaCV/PCV5相关病毒及新发现的10个基因组命名为猪Macochavirus（PMV），作为Macochavirus属内的一个猪相关谱系，从而解决了长期存在的分类学模糊性，并扩展了Pecoviridae科内cressdnaviruses的已知多样性。该论文发表在《Transboundary and Emerging Diseases》。

**关键技术方法**
样本来源：中国6个省份（广东、贵州、北京、安徽、福建、山西）的105份腹泻猪粪便。主要技术方法包括：1. 宏基因组测序：使用MGI平台进行100 bp单端测序。2. 生物信息学处理：fastp进行质控，Bowtie2去除宿主基因组（Sus scrofa）序列，SPAdes进行de novo组装，BLASTn比对nt数据库鉴定cressdnavirus候选。3. 基因组环形验证：通过末端序列重叠和reads回帖确认环形基因组。4. 系统发育分析：使用MAFFT进行多序列比对，IQ-TREE基于贝叶斯信息准则（BIC）选择最佳模型，构建最大似然树（1000次超快自举）。5. 序列同一性与遗传距离：使用序列分界工具（SDT）计算配对核苷酸同一性，MEGA计算遗传距离。6. 单倍型网络与核苷酸多样性：DnaSP识别单倍型，PopART基于TCS算法构建网络；滑动窗口分析（窗口200 bp，步长25 bp）计算核苷酸多样性（π）。

**研究结果**
**3.1. 腹泻猪中环状DNA病毒的鉴定和基因组特征**
通过宏基因组测序，从105份粪便样本中鉴定出10个完整环状病毒基因组，长度2881–2906 nt，均含有保守的九核苷酸基序TAGTATTAC（位于复制起点茎环结构内），以及双向取向的Rep和Cap基因。BLAST分析显示与FSfaCV/PCV5样病毒相似性最高。

**3.2. 系统发育分析揭示PCV5样病毒属于Pecoviridae科**
基于Rep氨基酸序列的最大似然树表明，新鉴定的10个基因组不聚类于Circoviridae（包括PCV1–PCV4），而是与FSfaCV/PCV5相关序列形成Pecoviridae科内的单系分支（自举值100）。

**3.3. 系统发育分析将猪FSfaCV/PCV5样病毒置于Macochavirus属**
基于完整基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的系统发育树均显示，10个新序列与FSfaCV/PCV5相关序列聚类，且该谱系与Macochavirus属参考序列相邻或嵌入其中，得到强支持（自举值99–100）。因此，这些病毒被提议为Macochavirus属内的猪谱系，命名为PMV。

**3.4. 序列同一性和遗传距离分析支持PMV谱系**
SDT分析显示，PMV序列之间同一性≥87%，与Macochavirus uywa的同一性为76.3%–80.0%，与其他属低于56.1%。遗传距离分析显示PMV内部距离<0.10，与Macochavirus参考序列距离0.24–0.36，与其他属>0.77。

**3.5. Pecoviridae序列的单倍型网络分析突出PMV谱系**
单倍型网络显示，PMV序列与FSfaCV/PCV5相关序列形成紧凑单倍型组，Macochavirus参考序列包含在该簇内，但突变步骤略多，其他属则分离较远。

**3.6. 全基因组核苷酸多样性模式支持PMV与Macochavirus的密切进化关系**
滑动窗口分析显示，PMV内部核苷酸多样性（π）较低且稳定；与Macochavirus比较时，多样性模式和局部波动最相似，且Rep区域（π≈0.04–0.11）比Cap区域（π≈0.03–0.07）差异更大。

**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管PMV基因组在腹泻猪中检出，但尚无直接证据表明其致病性，阳性样本中同时存在其他病毒和细菌（如猪博卡病毒、猪血清相关环状病毒、环状病毒、猪细小病毒5型、大肠杆菌、克雷伯菌属、链球菌属等），且粪便中检出不一定代表活跃感染，可能源于饮食或环境暴露。然而，近期研究显示FSfaCV/PCV5谱系在猪中高流行且病毒载量与病理损伤正相关，提示其可能具有致病潜力。PMV的鉴定丰富了猪cressdnavirus病毒组。在Pecoviridae科内，FSfaCV/PCV5相关病毒的分类学地位一直未定，现汇聚证据表明其构成Macochavirus属内的一个进化谱系。Rep和Cap区域的差异进化模式表明不同基因组区域对系统发育推断贡献不同，强调多基因标记的重要性。PMV在中国6个省份的检测扩展了其地理分布，建议持续监测和病毒分离以明确其流行病学和生物学特性。

结论部分翻译：总之，多种证据一致支持本研究中鉴定的病毒基因组与FSfaCV/PCV5相关病毒在Pecoviridae科内形成一个遗传上独特且稳定的谱系。这些独立分析方法的强一致性增强了该分类推断的稳健性，并清晰地将该谱系与该科其他成员区分开来。Rep和Cap蛋白的比较分析进一步揭示了不同基因组区域的异质性进化约束，强调了在cressdnaviruses分类中纳入多基因证据的重要性。本研究结果为猪cressdnaviruses的进化关系和分类框架提供了新见解，有助于更全面理解猪群中cressdnaviruses的遗传多样性。