《Journal of Hazardous Materials》：Nitrilase-mediated degradation of insecticides flonicamid and thiacloprid by immobilized engineered
Escherichia coli with a novel pathway
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摘要含腈类杀虫剂氟啶胺和噻虫嗪在农业中被广泛使用，会对环境和动物健康构成威胁。腈水解酶是降解腈类化合物的关键催化剂，而固定化的工程细菌则被用于废水处理。不过，目前尚未有研究探讨表达腈水解酶的固定化工程细菌在污染物降解中的应用。本研究将携带腈水解酶基因VbNitA的工程大肠杆菌pE
摘要
含腈类杀虫剂氟啶胺和噻虫嗪在农业中被广泛使用，会对环境和动物健康构成威胁。腈水解酶是降解腈类化合物的关键催化剂，而固定化的工程细菌则被用于废水处理。不过，目前尚未有研究探讨表达腈水解酶的固定化工程细菌在污染物降解中的应用。本研究将携带腈水解酶基因VbNitA的工程大肠杆菌pET28a-VbNitA通过海藻酸钙包埋法进行固定化。这些固定化细胞通过VbNitA将氟啶胺降解为N-(4-三氟甲基烟酰基)甘氨酸酰胺和4-(三氟甲基)烟醇甘氨酸，同时也能将噻虫嗪转化为噻虫嗪酰胺和噻虫嗪亚胺。值得注意的是，这是首次报道腈水解酶能够将噻虫嗪转化为噻虫嗪酰胺，以及发现噻虫嗪亚胺作为其生物降解中间体。与游离细胞相比，固定化的大肠杆菌pET28a-VbNitA对高温、碱性和酸性环境的耐受性更强，且长期储存稳定性更好。底物抑制模型显示，该固定化菌株降解氟啶胺和噻虫嗪的最佳初始浓度分别为45.13微摩尔/升和127.50微摩尔/升。固定化细胞降解氟啶胺的速度比降解噻虫嗪更快。分子对接分析表明，氟啶胺和噻虫嗪都能与VbNitA形成稳定结合，其中氟啶胺与催化三联体的Cys165距离更近。本研究提出了一种新的噻虫嗪降解途径，同时也为含腈类杀虫剂的废水处理提供了一种高效的新型固定化生物催化剂。
引言
氟啶胺和噻虫嗪是两种结构不同的杀虫剂，但它们都含有一个共同的官能团——腈基（–C≡N），这一结构通常与生物活性和潜在毒性相关[1][2][3]。氟啶胺主要用于防治半翅目害虫，而噻虫嗪则对吸汁昆虫、象甲和叶矿虫有很好的杀灭效果[4][5]。尽管两者结构不同，但都引发了环境和健康方面的担忧。在甜椒、啤酒花、茶叶甚至人类尿液中都检测到了氟啶胺残留，高剂量氟啶胺还会导致小鼠的基因组损伤[4][6][7][8][9][10]。此外，氟啶胺的水溶性很高（20℃时为5.2克/升），这对水生环境尤其构成威胁。研究表明，接触噻虫嗪会降低大黄蜂的存活率和繁殖能力，影响雄蜂的发育，还会减少土壤微生物和水生无脊椎动物的数量[11][12][13]。因此，这两种杀虫剂都可能对环境和动物造成危害。微生物修复是一种绿色且有效的方法，可用于清理被杀虫剂污染的环境，因此人们非常关注氟啶胺和噻虫嗪的生物降解过程及其在环境中的命运。
目前已分离出许多野生型微生物菌株，它们具有降解氟啶胺、噻虫嗪或两者兼有的能力。在氟啶胺降解方面，已有多种菌株被报道，比如粪肠球菌CGMCC 17553、施氏假单胞菌CGMCC 22915、氨基杆菌CGMCC 1.17253、水杨酸氧化假单胞菌CGMCC 1.17248以及人类赭色杆菌CGMCC 1.17249（见图1A）[14][15][16][17][18]。在噻虫嗪降解方面，也发现了其他一些菌株，包括粘液红酵母IM-2、金孢曲霉、印度假单胞菌CGMCC 6648以及麦芽嗜酸短杆菌CGMCC 1.1788（见图1B）[19][20][21][22]。另外，还有四种菌株能够降解这两种杀虫剂，分别是苜蓿短杆菌CGMCC 7333、附着短杆菌CGMCC 6315、絮凝微杆菌CGMCC 1.16731以及硼酸化多形菌CGMCC 4969[23][24]。这些菌株通过水合、水解和羟基化途径，将氟啶胺降解为N-(4-三氟甲基烟酰基)甘氨酸酰胺、4-(三氟甲基)烟醇甘氨酸和5-三氟甲基烟酸，同时将噻虫嗪转化为噻虫嗪酰胺和4-羟基噻虫嗪[23][24]。与游离细胞相比，固定化细胞在废水处理过程中 biomass损失更少，更易于分离和重复使用，更能抵御恶劣环境，也更适合用于连续流反应器中[25][26]。不过，在上述野生菌株中，只有固定化的附着短杆菌CGMCC 6315被用于氟啶胺降解研究，但其降解效率较低[27]。
与野生型菌株相比，表达降解酶的工程细菌通常具有更高的杀虫剂降解能力。例如，水杨酸氧化假单胞菌CGMCC 1.17248在0.99毫米摩尔/浓度的氟啶胺存在下，18.7小时即可将其完全降解。而表达该菌株所携带的腈水合酶的大肠杆菌pET28a-AnhB，则在12小时内就能将相同浓度的氟啶胺完全分解[28]。类似地，絮凝微杆菌CGMCC 1.16731降解0.63毫米摩尔/浓度的噻虫嗪的半衰期为9.0小时。而表达同种细菌的腈水合酶的工程菌株大肠杆菌-pNABC，仅在10分钟内就能降解97.2%的噻虫嗪[29]。目前已发现的氟啶胺降解酶包括腈水合酶、腈水解酶和酰胺酶，而噻虫嗪降解酶则包括腈水合酶和细胞色素P450[23][24]。基于这些酶，研究人员制备了两种用于降解氟啶胺和噻虫嗪的固定化工程菌株。一种是大肠杆菌pET28a-PsNHase-PsCbiM，它表达了来自施氏假单胞菌CGMCC 22915的腈水合酶和钴转运蛋白，能够高效降解氟啶胺和噻虫嗪[1]。另一种是恶臭假单胞菌KT2440 pLSJ15-amiA，它表达了来自施氏假单胞菌CGMCC 22915的酰胺酶，可快速降解TFNA-AM[26]。经过固定化处理后，这两种菌株对恶劣环境的耐受性显著提升，且具备良好的储存稳定性和重复使用性能。然而，目前还从未有研究探讨过表达腈水解酶的固定化工程细菌在降解氟啶胺或噻虫嗪方面的应用。
在我们之前的研究中，发现来自硼酸化多形菌CGMCC 4969的腈水解酶VbNitA能够快速降解氟啶胺[30]。但目前关于利用携带腈水解酶基因的固定化工程大肠杆菌进行污染物降解的研究还很少。本研究将表达VbNitA的工程大肠杆菌pET28a-VbNitA通过海藻酸钙进行固定化，随后通过扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱技术分析了这些固定化细胞的形态和化学性质。结果表明，这些固定化工程大肠杆菌对氟啶胺具有很高的降解能力。值得注意的是，通过VbNitA，这些固定化菌株还能有效降解噻虫嗪，同时研究人员还发现了一种新的噻虫嗪降解途径。本研究比较了自由状态和固定化状态的大肠杆菌pET28a-VbNitA在温度和pH值变化下的催化活性及稳定性，评估了其储存稳定性和重复使用性能，还分析了该菌株对不同浓度氟啶胺和噻虫嗪的降解动力学。通过底物抑制模型，确定了该固定化菌株降解氟啶胺和噻虫嗪的最佳初始浓度。最后，通过三维建模和分子对接技术，揭示了VbNitA与这两种底物之间的相互作用机制。本研究首次证明了腈水解酶可以通过一种新途径降解噻虫嗪，同时也成功开发出一种高效的生物修复剂，可用于处理氟啶胺和噻虫嗪污染问题。
章节节选
化学品与菌株
氟啶胺（纯度95%）和噻虫嗪（纯度97%）分别从中国武汉的湖北正兴源精细化工有限公司和中国苏州的常熟恒荣新材料科技有限公司购买。色谱级乙腈和醋酸则购自中国南昌的南昌启普科技有限公司。试剂级海藻酸由上海桑根生物技术公司提供，其他分析级试剂则从国药集团化学试剂有限公司购买。
扫描电镜与傅里叶变换红外光谱分析
大肠杆菌pET28a-VbNitA通过海藻酸钙得到了良好的固定化处理，形成了直径约为2毫米的颗粒。随后通过扫描电镜观察了空白海藻酸钙颗粒、游离状态的大肠杆菌pET28a-VbNitA以及固定化后的菌株的表面形态。游离细胞呈现为表面光滑的短棒状，且分布密集且随机（见图2A）。而空白海藻酸钙颗粒的表面则较为粗糙，呈不规则的块状，还存在裂纹、孔洞以及片状结构。
结论
综上所述，携带腈水解酶基因VbNitA的工程大肠杆菌pET28a-VbNitA已经通过海藻酸钙包埋法成功实现固定化。通过VbNitA的作用，氟啶胺被降解为N-(4-三氟甲基烟酰基)甘氨酸酰胺和4-(三氟甲基)烟醇甘氨酸，而噻虫嗪则被转化为噻虫嗪酰胺和噻虫嗪亚胺。这是首次有研究报道腈水解酶能够将噻虫嗪转化为噻虫嗪酰胺，同时也明确了噻虫嗪亚胺是噻虫嗪的生物降解中间体。与游离细胞相比，固定化的大肠杆菌pET28a-VbNitA具有更高的
作者贡献说明
戴义军：撰写——审阅与编辑、指导、资源提供、方法设计、概念构思。张庆华：撰写——审阅与编辑、指导、资源提供、方法设计、资金获取、概念构思。安学教：软件应用、方法设计、数据整理。石景亮：方法设计、数据整理。张明明：可视化处理、结果验证、软件应用、方法设计、数据整理。裴瑞：可视化处理、软件应用、方法设计。江霍勇：撰写——审阅与编辑、撰写——原始内容。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联。
致谢
本研究得到了江西省自然科学基金（项目编号20262BAC200235）、江西省教育部门自然科学基金（项目编号GJJ2500306）、江西省青年科技人才培育计划（项目编号20252BEJ730049）、江西省自然科学基金重点项目（项目编号20253BAC280015）以及江西省研究生创新专项基金的支持。
江霍勇|何正英子|张明明|裴瑞|安学教|石景亮|戴义军|张庆华
中国江西省南昌市330045，江西农业大学生物科学与生物工程学院
