新型苯磺酰胺连接噁二唑-吡啶杂化分子作为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的双重抑制剂：设计、合成、生物学评估及计算研究

《Journal of Molecular Structure》：Novel Benzensulfonamide-linked Oxadiazole-pyridine Hybrids as Dual Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Inhibitors: Design, Synthesis, Biological Evaluation and Computational Studies

　　•新型苯磺酰胺-噁二唑/吡啶偶联物7a-h已被合成。•这些目标化合物表现出对AChE和BChE的双重强效抑制活性。•化合物7b和7e具有抑制Aβ聚集及金属螯合的作用。•针对AChE和BChE进行了分子对接研究及分子动力学模拟。•对化合物7b和7e的DFT分析证实了它们的稳定性与反应性。

引言
阿尔茨海默病是一种影响老年人的神经退行性疾病[[1], [2], [3], [4]]。根据世界卫生组织的数据，阿尔茨海默病是最常见的痴呆类型，占所有痴呆病例的60%-70%[5]。在美国，阿尔茨海默病是第七大死亡原因，在65岁以上人群中则为第六大死因。全球患有阿尔茨海默病的人数约为3200万，若将处于疾病前驱期和临床前期的人群纳入统计，则总数可达4.16亿[6]。该病的高发率使其成为一项公共卫生问题，同时也带来了巨大的社会和经济负担[7]。

阿尔茨海默病的症状包括记忆力减退、解决问题能力下降、性格和情绪波动以及判断力或决策能力受损[8]。该病的进展与多种异常现象有关，如乙酰胆碱水平降低、过度磷酸化的tau蛋白沉积、β-淀粉样蛋白积累、氧化应激以及神经炎症[9,10]。乙酰胆碱酯酶对于学习、记忆功能以及其他认知过程至关重要[11]。乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶都会将乙酰胆碱分解为胆碱和醋酸，从而在胆碱能神经元激活后帮助其恢复到静息状态。这两种酶共同调控着乙酰胆碱的水平，维持正常的胆碱能功能[12,13]。乙酰胆碱酯酶通过其外周阴离子位点中的疏水环境与β-淀粉样蛋白结合，进而促进β-淀粉样蛋白纤维的形成及其聚集成淀粉样结构。因此，能够与乙酰胆碱酯酶外周阴离子位点结合的分子有望抑制β-淀粉样蛋白的聚集[14,15]。此外，阿尔茨海默病患者大脑中Cu2+、Zn2+和Fe2+等金属离子的动态平衡发生改变，这与β-淀粉样蛋白的积累密切相关。这些离子在β-淀粉样蛋白斑块中的浓度升高，进一步增强了β-淀粉样蛋白聚集体的稳定性[16,17]。

虽然多奈哌齐是一种有效的选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，被用于治疗阿尔茨海默病，但越来越多的证据表明，同时抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶可能在控制阿尔茨海默病方面具有更好的治疗效果。多项研究表明，在阿尔茨海默病的中期和晚期，患者的丁酰胆碱酯酶活性显著升高，而此时乙酰胆碱酯酶活性则下降，丁酰胆碱酯酶便承担起代谢乙酰胆碱的任务。因此，在这一阶段使用选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂的效用有限。所以，开发兼具两种酶抑制活性的药物不仅可以克服选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂的耐药性问题，还能有效治疗症状中度至重度的阿尔茨海默病患者[[18], [19], [20]]。这两种酶的活性位点之间存在一个重要差异：丁酰胆碱酯酶的某些芳香族残基被更灵活的残基所取代，这使得相对较大的抑制剂能够与其结合[21]。

1,3,4-噁二唑是一类具有重要生物活性的杂环化合物，因而受到了广泛关注[22,23]。1,3,4-噁二唑Ia和Ib在亚微摩尔浓度下就能有效抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，同时还具有抑制Aβ聚集的作用，并对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞具有神经保护效应[24]（见图1）。另外，一组名为II的1,3,4-噁二唑衍生物也显示出对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的强效抑制作用，其IC50值均低于10微摩尔[25]。最近的一项研究指出，噁二唑-苯并二氧辛杂环类杂交分子IIIa、IIIb是高效的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制剂，其针对乙酰胆碱酯酶的IC50值分别为0.05微摩尔和0.08微摩尔，其对丁酰胆碱酯酶的抑制效果与多奈哌齐相当，后者的IC50值分别为2.16微摩尔和4.50微摩尔[26]。

与此同时，吡啶环也因其在具有多种药理活性的生物活性分子中的存在而备受关注，例如化合物IV和V，它们具有抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶、抑制Aβ聚集以及金属螯合的作用[27,28]。此外，吡啶衍生物VI也能抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，其IC50值分别为0.49微摩尔和3.82微摩尔，该物质能显著降低大脑前额叶皮层、海马体和下丘脑中的乙酰胆碱酯酶活性[29]。另外，噁二唑-吡啶衍生物VIIa也能抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，其IC50值分别为1.098微摩尔和7.794微摩尔，同时还能将乙酰胆碱酯酶诱导的Aβ聚集抑制38.2%-65.9%。其类似物VIIb则是高效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其IC50值为0.83微摩尔[30,31]。

苯磺酰胺是另一类重要的结构骨架，它为药物化学领域提供了许多具有多种生物活性的候选分子[[32], [33], [34], [35], [36], [37]]。已有研究表明，某些二元苯磺酰胺具有胆碱酯酶抑制作用，例如化合物VIII（见图2），它对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶均有较强的抑制效果，其IC50值分别为8.19微摩尔和13.41微摩尔[38]。此外，喹啉-苯磺酰胺杂交分子IX也能在低于5微摩尔的IC50值下抑制这两种酶，同时还具有金属螯合能力[39]。对氨基苯甲酸的磺酰胺衍生物X是一种选择性的丁酰胆碱酯酶抑制剂，其在纳米摩尔浓度下即可发挥作用[40]；而其醋酰胺衍生物XI则主要对丁酰胆碱酯酶具有选择性抑制作用，且不会对SH-SY5Y细胞系的存活产生不良影响[41]。

分子杂化策略被广泛用于开发治疗阿尔茨海默病的新生物活性候选分子。这种策略是通过将两个或多个不同的药效团整合到一个分子中，从而产生协同效应，提升分子的总体活性[25,30]。基于上述研究结果，我们设计了通过2-巯基乙酰胺连接剂将2-(吡啶-3-基)-1,3,4-噁二唑与苯磺酰胺核心相连的分子杂化物7a-h（见图3）。在本研究中，我们对多奈哌齐进行了结构改造，旨在将其原本以乙酰胆碱酯酶为主要抑制靶点的特性转变为同时抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。在我们设计的化合物7a-h中，多奈哌齐的吲哚酮环被苯磺酰胺基团取代，这样既能增加分子的氢键结合能力，又能调节分子的极性，从而增强其与丁酰胆碱酯酶更为宽敞且灵活的活性位点凹槽的相互作用，同时仍保留与乙酰胆碱酯酶相互作用的所需芳香族残基。此外，苄基哌嗪类的碱性片段也被替换成了由噁二唑连接的吡啶构成的平面杂环结构，以此来调节分子的碱性、增强结构刚性、提高代谢稳定性，同时仍保持与两种酶活性位点凹槽中的氨基酸发生相互作用的能力。随后，我们对这些合成化合物进行了对乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的抑制活性测试。其中活性最强的化合物还进一步接受了针对Aβ聚集抑制作用以及针对SHSY5Y细胞系的神经毒性测试。同时，我们还对这些酶进行了分子对接和分子动力学研究。

化学部分
最终化合物7a-h的合成过程如图1所示。苯磺酰胺类化合物3a-h是根据已有报道的方法[42]制备的，具体是在无水四氢呋喃中，以等摩尔比例将对苯二胺（1）与相应的苯磺酰氯2a-h在三乙胺的存在下进行反应。随后，按照已有报道的方法[[43], [44], [45]]，在无水DMF中对这些胺类物质进行氯乙酰化反应，从而得到二级酰胺4a-h，其结构已通过相关分析得到确认。

一般说明
有机溶剂和精细化学品均从商业供应商处采购。薄层色谱分析在预涂有硅胶60 F245的铝板上进行，通过紫外光观察结果。熔点测定则使用熔点分析仪（韩国Daihan Scientific公司生产）进行，所得数据未经校正。红外光谱分析则是利用溴化钾压片，通过日本京都岛津公司的FT/IR傅里叶变换红外光谱仪[8400型]来完成。核磁共振光谱分析则采用了相应仪器进行。

结论
为了寻找治疗阿尔茨海默病的新方法，我们合成了一系列2-(吡啶-3-基)-1,3,4-噁二唑与苯磺酰胺核心7a-h相连的化合物，并评估了它们作为乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶双重抑制剂的效果。实验结果表明，所有化合物对这两种酶都具有优异到良好的抑制活性，且并未表现出对其中某一种酶的过高选择性，这一特点对于治疗中度及重度阿尔茨海默病而言具有积极意义。目前所研究的全部化合物均……

作者贡献声明
Rasha M. Hassan：概念设计、数据整理、定量分析、研究实施、方法设计、结果验证、初稿撰写、审阅与编辑。
Mohammed S. Abdel-maksoud：概念设计、数据整理、定量分析、研究实施、方法设计、结果验证、初稿撰写、审阅与编辑。
Ibrahim M. Ibrahim：定量分析、方法设计、结果验证、初稿撰写、审阅与编辑。
Marwa R. Elgarhy：定量分析、方法设计、结果验证、初稿撰写。

数据可用性
数据将在收到请求后提供。

利益冲突声明
作者声明不存在需要披露的利益冲突。

CRediT作者贡献声明
Rasha M. Hassan：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、结果验证、方法设计、研究实施、定量分析、数据整理、概念设计。
Mohammed S. Abdel-maksoud：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、结果验证、方法设计、研究实施、定量分析、数据整理。
Ibrahim M. Ibrahim：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、结果验证、方法设计、定量分析。
Marwa R. Elgarhy：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写。

利益冲突声明
作者不存在需要披露的利益冲突。

致谢
作者们要感谢埃及米斯尔科技大学的药物科学及制药学院Walaa Hamada Abd-Allah教授在分子对接研究方面所提供的帮助。同时，我们也要感谢塞浦路斯研究所为我们提供的高性能计算资源，用于分子动力学模拟的计算工作。

Rasha M. Hassan|Mohammed S. Abdel-maksoud|Ibrahim M. Ibrahim|Marwa R. Elgarhy|Faten Farouk|Mohamed F. Hamissa|Dalal Z. Husein|Iman A.Y. Ghannam