莱菔子提取物靶向las群体感应系统抑制铜绿假单胞菌生物膜和信号分子产生

《Food Science & Nutrition》：Raphani Semen Extract Targets the las Quorum Sensing System to Suppress Pseudomonas aeruginosa Biofilm and Signal Molecule Production

　　

研究人员利用亚抑制浓度的莱菔子提取物（RSE，≤256 μg/mL）、萝卜硫素（SFA）和萝卜硫素腈（SFE，12.5–100 μM），评估了它们对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1生物膜形成、细菌运动性、毒力因子产生及信号分子水平的影响，并结合荧光报告菌株检测、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用（UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS）进行机制和植物化学分析。结果显示，RSE抑制了50.93%的生物膜形成，减弱了运动性，并降低了3-氧代-C12-高丝氨酸内酯（3-oxo-C12-HSL）的产生。研究人员发现RSE下调了关键群体感应（QS）基因（lasR、lasA、lasB、pqsA和pqsR）的表达，并抑制了lasB/pqsA报告菌株的活性。植物化学分析鉴定出71种成分，随后的验证显示SFA和SFE复制了这些效应，并在las、pqs和rhl系统中表现出更广的QS抑制作用。SFA（100 μM）表现出特别强的效力，使3-oxo-C12-HSL降低了74.29%。分子对接表明SFA和SFE可与LasB、RhlA和PqsA结合，尽管亲和力适中。这些发现表明，RSE及其活性成分SFA和SFE是有效的QS抑制剂，主要通过破坏las系统来减弱铜绿假单胞菌的致病性，提示它们作为天然抗生物膜剂的潜力，可能靶向QS系统的多个组分。

**论文解读：莱菔子提取物通过靶向las群体感应系统抑制铜绿假单胞菌生物膜与信号分子**

**研究背景与问题**

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在的革兰氏阴性条件致病菌，在呼吸系统感染中构成严重威胁。世界卫生组织（WHO）已将其列为高优先级抗生素耐药病原体。该菌通过复杂的群体感应（Quorum Sensing, QS）网络协调群体行为，包括生物膜形成和毒力因子分泌，这些特性对其致病性和抗生素耐药性至关重要。传统的抗生素疗法易诱导耐药性，而靶向QS的群体感应抑制剂（Quorum Sensing Inhibitors, QSIs）通过抑制致病性而不施加选择性压力，成为抗耐药性（Anti-Antimicrobial Resistance）的新兴策略。铜绿假单胞菌的QS系统包含三条相互关联的通路：las、rhl和pqs，其中las系统（以信号分子N-(3-氧代十二烷酰基)-L-高丝氨酸内酯，即3-oxo-C12-HSL为核心）作为上游调控器，启动下游毒力基因的转录级联并促进生物膜基质产生。因此，靶向las系统是同时抑制毒力和生物膜相关耐受性的有前景策略。

天然产物是高效低毒的先导化合物宝库，在QSIs筛选中备受关注。莱菔子（Raphani Semen, RS）是萝卜（Raphanus sativus L.）的干燥成熟种子，传统中医用于治疗呼吸和胃肠道疾病，富含硫代葡萄糖苷、异硫氰酸酯等成分。研究人员的前期研究提示莱菔子提取物（RSE）可能具有QS干扰活性。因此，本研究旨在阐明RSE及其特征性成分萝卜硫素（Sulforaphane, SFA）和萝卜硫素腈（Sulforaphene, SFE）是否通过靶向特定QS通路抑制铜绿假单胞菌生物膜和毒力，为开发新型天然抗生物膜剂提供依据。该论文发表在《Food Science》。

**主要技术方法**

研究人员以铜绿假单胞菌野生型PAO1（ATCC 15692）为模型菌株，并使用了四种荧光报告菌株（PAO1 gfp、PAO1 lasB-gfp、PAO1 rhlA-gfp、PAO1 pqsA-gfp，由新加坡南洋理工大学Liang Yang教授惠赠）。采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），结晶紫染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合COMSTAT2软件评估生物膜抑制。通过半固体琼脂平板测定运动性（泳动和群集运动）。利用酶标仪、分光光度法或比色法检测弹性蛋白酶、绿脓菌素、鼠李糖脂和胞外多糖（EPS）等毒力因子。采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用（UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS）进行植物化学成分分析和信号分子3-oxo-C12-HSL定量。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测QS相关基因表达，并利用荧光报告菌株监测QS通路活性。分子对接（Schr?dinger Suite 2023-4）模拟SFA和SFE与LasB（PDB: 8CC4）、RhlA（PDB: 8IK2）和PqsA（PDB: 5OE5）的结合。所有实验至少三次独立生物学重复，采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。

**研究结果**

**3.1 MIC与生物膜形成抑制：** 肉汤微量稀释显示RSE对PAO1的MIC>512 μg/mL，生长曲线证实亚抑制浓度（≤256 μg/mL）不显著影响生长。结晶紫染色表明RSE以剂量依赖方式抑制生物膜形成，256 μg/mL时减少约50%。CLSM和COMSTAT分析进一步证实RSE处理组总生物量（下降显著，p<0.05至p<0.0001）和平均厚度均显著降低，且无死菌比例增加，提示抑制源于粘附受损而非杀菌作用。

**3.2 RSE对运动性的影响：** 在半固体琼脂实验中，RSE以剂量依赖方式抑制群集和泳动运动，128 μg/mL时分别减少75.21%和77.07%（p<0.001），表明RSE通过靶向运动性（与QS调控相关）损害早期定植。

**3.3 RSE对毒力因子的抑制：** RSE显著降低绿脓菌素和弹性蛋白酶（LasB）分泌，256 μg/mL时弹性蛋白酶活性下降77.07%。鼠李糖脂产量对RSE反应微弱，提示RSE优先靶向las/pqs系统。

**3.4 RSE对铜绿假单胞菌QS通路的抑制：** 荧光报告菌株实验显示，RSE剂量依赖性地降低PAO1 lasB-gfp和PAO1 pqsA-gfp荧光强度，但对PAO1 rhlA-gfp无显著影响。UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS定量结果表明，RSE处理使3-oxo-C12-HSL浓度下降59.38%（256 μg/mL）。qRT-PCR证实RSE下调lasR、lasA、lasB、pqsA和pqsR表达（lasA降低55%，lasB降低42%，pqsA降低约25%），但lasI转录略有升高（约24%），提示RSE可能通过干扰信号分子积累或受体功能破坏las通路。

**3.5 RSE的定性分析：** UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS在RSE中鉴定出71种化合物，包括12种硫代葡萄糖苷、6种异硫氰酸酯、15种酚酸（含6种芥子碱衍生物）、15种芥子酸酯、7种黄酮类和16种其他代谢物。

**3.6 SFA和SFE的MIC与生物膜抑制：** SFA和SFE的MIC均>1000 μM。亚抑制浓度（12.5–100 μM）下，两者以剂量依赖方式抑制生物膜形成，50 μM时抑制约50%，100 μM时SFA和SFE分别抑制67.8%和52.4%。CLSM也证实生物膜厚度和结构复杂性降低。棋盘微量稀释法显示SFA与阿米卡星（FICI=0.3）和头孢他啶（FICI=0.128）呈协同作用，SFE与头孢他啶协同（FICI=0.3），与阿米卡星相加（FICI=0.6）。

**3.7 SFA和SFE对运动性和毒力因子的影响：** 两者均剂量依赖性地抑制群集和泳动运动（100 μM时SFA分别减少57.9%和49.3%，SFE分别减少55.5%和53.8%），并显著抑制绿脓菌素（SFA抑制62.6%，SFE抑制42.3%）和EPS（SFE抑制65.6%，SFA抑制38.2%），但对鼠李糖脂影响微弱。

**3.8 SFA和SFE对QS通路的抑制：** 荧光报告菌株显示，SFA和SFE均剂量依赖性地抑制lasB-gfp、rhlA-gfp和pqsA-gfp荧光（与RSE不同，两者也抑制rhlA表达）。3-oxo-C12-HSL定量显示，100 μM SFA和SFE分别使其减少74.29%和51.43%。

**3.9 分子对接：** 对接结果显示SFA和SFE与LasB、RhlA和PqsA结合，但亲和力适中（结合能-3.2至-4.7 kcal/mol）。SFE与LasB的催化中心邻近，SFA与RhlA的Ala36形成氢键，SFE与PqsA的Thr304形成氢键，支持其多靶点作用机制。

**讨论与结论总结**

研究人员通过讨论指出，RSE及其异硫氰酸酯成分SFA和SFE主要通过破坏las群体感应系统抑制铜绿假单胞菌生物膜和毒力，与传统抗生素不同，QS抑制剂不直接杀灭细菌，降低耐药风险。RSE减少las特异性自诱导剂3-oxo-C12-HSL（降幅达59%），下调lasR和lasI表达，弹性蛋白酶和绿脓菌素下降是las抑制的下游结果。与姜黄素等植物源QSIs类似，但RSE对rhl系统影响微弱，这种窄特异性可能减少对有益微生物群的脱靶效应。纯化单体SFA和SFE复制了RSE的关键抗生物膜和抗毒力效应，但表现出更广活性（抑制rhlA-gfp转录），可能与粗提物中存在拮抗成分或单体生物利用度更高有关。SFA/SFE显著降低rhlA-gfp荧光但鼠李糖脂产量未显著变化，可能是由于鼠李糖脂合成需多酶（RhlA、RhlB、RhlC）协同，转录下调不足以限制终产物形成，且存在转录后调控补偿。分子对接结合能较弱（-3.2至-4.5 kcal/mol），但多靶点低亲和力相互作用在QSIs中常见。从食品科学角度，莱菔子作为“药食同源”物质，其异硫氰酸酯可开发为天然食品防腐剂或膳食佐剂，增强抗生素疗效。研究局限性包括仅使用野生型PAO1、缺乏体内验证、单体未进行qRT-PCR、对接需实验验证等。

**研究结论翻译：** 在本研究中，通过UPLC-Q-Orbitrap-MS/MS进行的植物化学表征鉴定出RSE中的71种化合物。在这些成分中，SFA和SFE被确定为对铜绿假单胞菌PAO1产生QS抑制作用的关键活性成分。研究人员的发现表明，SFA和SFE均特异性地靶向las QS系统，显著抑制关键毒力表型，包括生物膜形成、细菌运动性以及毒力因子和信号分子3-oxo-C12-HSL的产生。在分子水平上，这些表型效应与las系统基因的下调及其启动子活性的抑制相关，QS报告菌株检测证实了这一点。总之，这些结果将RSE及其活性成分SFA和SFE定位为新型抗毒力策略的有前景候选物。它们通过破坏铜绿假单胞菌的通信和毒力网络，提供了一种应对其致病性的可行方法，从而可能缓解传统抗生素耐药性的发展。