《Neurochemistry International》：WAC loss alters food-associated behavior and physiological homeostasis with stage-associated cholinergic dysregulation in
Caenorhabditis elegans
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摘要WAC是一种与染色质相关的调控蛋白，参与转录调控，在人类遗传学研究中被确定为与自闭症相关的基因。然而，它在调节行为和突触过程中的功能作用仍不完全清楚。我们利用秀丽隐杆线虫，研究了wac基因缺失对与食物相关的社会行为、生长相关表型以及胆碱能通路功能的影响。wac基因缺失的线虫在
摘要
WAC是一种与染色质相关的调控蛋白，参与转录调控，在人类遗传学研究中被确定为与自闭症相关的基因。然而，它在调节行为和突触过程中的功能作用仍不完全清楚。我们利用秀丽隐杆线虫，研究了wac基因缺失对与食物相关的社会行为、生长相关表型以及胆碱能通路功能的影响。wac基因缺失的线虫在离开食物的行为上明显减少，表明其对与食物相关的环境信号的行为反应能力受损，而聚集行为则没有显著变化。PHX2587 wac基因删除突变体线虫的体长也有所缩短，咽部蠕动减弱，寿命降低，这说明其生长和生理功能存在更广泛的损害。通过对胆碱能通路基因在不同发育阶段的分析，发现多个突触前和突触后的胆碱能成分（ace-1、cha-1、cho-1、lev-1、lev-10、unc-17、unc-29、unc-38和unc-50）在幼年成虫阶段出现明显的上调。功能性RNAi分析进一步确定，编码高亲和力突触前胆碱转运蛋白的cho-1是PHX2587线虫中胆碱能敏感性的基因型特异性调节因子。重要的是，cho-1 RNAi不仅降低了阿尔迪卡布中毒的敏感性，还部分缓解了体长缩短的表型，并改善了PHX2587线虫离开食物的行为，而在野生型N2线虫中则效果有限。这些发现表明wac基因缺失与cho-1相关的胆碱能调节之间存在功能关联，说明突触前胆碱转运在wac基因缺失所导致的某些行为和生理变化中起着重要作用。
引言
自闭症谱系障碍是一种神经发育性疾病，其特征为社交沟通能力和重复性行为模式出现异常，这类疾病通常由复杂的遗传和神经生物学机制引发（Christensen等人，2019；Lord等人，2018）。被诊断为神经发育障碍的患者，如自闭症患者，往往表现出社交行为异常，以及对感官和环境刺激的反应不典型（Frye，2018；Posar和Visconti，2018；Roley等人，2015；Thye等人，2018）。尽管大规模的遗传学研究已经发现了许多与自闭症相关的基因（Garcia-Forn等人，2020），但目前的挑战在于确定单个风险基因如何影响特定的行为领域，以及将这些效应与那些能够将分子层面的紊乱转化为电路层面功能障碍的保守突触通路联系起来（Bonsi等人，2022；Sahin和Sur，2015）。在人类遗传学研究中，WAC（含有WW结构域且具有卷曲螺旋结构的适配蛋白）也被认定为与自闭症相关的基因（Sanders等人，2015；Satterstrom等人，2020）。WAC的致病变异还与德桑托-希纳维综合征有关，这是一种神经发育障碍，表现为智力缺陷和行为异常，包括自闭症相关特征（Alsahlawi等人，2020；Leonardi等人，2020；Lugtenberg等人，2016；Morales等人，2022；Uehara等人，2018）。然而，WAC功能下降与多种行为异常有关，包括焦虑、注意力缺陷/多动障碍、睡眠障碍、攻击性行为以及自闭症相关特征（Varvagiannis等人，1993），但目前尚不清楚是哪些突触机制导致了这些现象。在分子层面，WAC与关键的调控过程有关，包括依赖染色质的转录、mTOR信号传导以及自噬作用（David-Morrison等人，2016；Joachim等人，2015；Zhang和Yu，2011）。最近，针对神经元系统的结构-功能研究进一步明确了WAC的亚细胞定位，并发现了可能与神经元信号传导相关的调控基序（Rudolph等人，2023）。不过，要将这些分子层面的发现转化为可验证的、基于机制的假说，从而将突触功能障碍与行为表型联系起来，仍然面临诸多挑战，这就需要建立能够同时实现行为量化检测和严格机制验证的体内模型。
秀丽隐杆线虫具有多种觅食行为，因此可作为一种易于操作的体内模型，用于将基因功能与突触机制及行为表现联系起来（Mizumoto等人，2023；Rand，2007）。它的神经系统已经被充分研究，主要的神经递质通路具有保守性，而且其行为测试可以在严格控制的发育阶段进行量化分析（Cook等人，2019b；White等人，1986a）。在秀丽隐杆线虫中，离开食物的行为被广泛用作衡量与食物相关的社会行为的指标，这一方法也被用于研究与神经发育障碍相关的基因，包括与自闭症相关的基因（Bendesky等人，2011；Milward等人，2011；Rawsthorne等人，2021b）。先前的研究表明，与自闭症相关的基因，如神经连接蛋白（nlg-1），的突变会改变线虫离开食物的行为，这进一步证明了该行为指标在反映社会功能和感觉处理方面的实用性（Rawsthorne等人，2021a；Rawsthorne等人，2021b）。在本研究中，VC228/nlg-1被作为用于检测食物相关行为变化的参考品系，而非用于比较WAC调控的胆碱能功能的对照品系。与此同时，可以通过互补的分子和功能方法来研究胆碱能信号传导（Mahoney等人，2006；Rand，2007）。转录组分析可以识别出潜在的通路组成成分，而像阿尔迪卡布敏感性测试这样的药理学检测方法，则可以为神经肌肉接头处的乙酰胆碱神经传递提供可靠的功能评估依据（Sammi等人，2022；Sammi等人，2017）。
在我们之前的研究中（Boonpraman等人，2026），我们将秀丽隐杆线虫的行为表型分析与小鼠的相应研究相结合，发现WAC功能异常会导致可测量的神经行为变化。在WAC杂合小鼠中，CHRNA7在皮质中的表达增加，这进一步提示WAC功能与胆碱能调节之间可能存在关联（Boonpraman等人，2026）。这些发现促使我们在遗传学上更为易操作的秀丽隐杆线虫模型中进行进一步研究，以确定胆碱能基因表达的变化是否会导致可测量的功能性和行为性结果。在这里，我们提出了这样一个假设：wac基因的缺失会改变秀丽隐杆线虫对与食物相关的行为反应以及胆碱能通路的功能。为验证这一假设，我们首先确定了基础性的发育和生理表型，以避免可能对行为产生干扰的因素。随后，我们以离开食物的行为作为与食物相关的行为指标，以聚集行为作为补充的群体行为检测指标。与我们之前主要针对幼年成虫阶段的研究不同，我们在这次研究中对从幼虫期（L1–L4）到幼年成虫期的整个发育阶段进行了分阶段的转录组分析，旨在确定wac基因缺失后胆碱能通路出现差异的时间点，这一时间点与神经发育障碍的早期发病特征相吻合。最后，为了评估这些基因的功能重要性，我们使用RNAi技术针对部分上调的胆碱能基因进行了研究，并通过阿尔迪卡布测试来评估它们对突触功能的影响，其中重点关注cho-1这种基因型特异性因子，它可能对某些与wac基因缺失相关的表型具有调节作用。
章节摘录
品系、细菌饲料及一般培养条件
野生型秀丽隐杆线虫（N2）、wac基因缺失突变体PHX2587（wac-1.1；wac-1.2）以及VC228（nlg-1）均来自明尼苏达大学的秀丽隐杆线虫遗传学中心。VC228被用作离开食物行为检测的阳性对照品系（Rawsthorne等人，2021a；Rawsthorne等人，2021b）。这些线虫在含有大肠杆菌OP50的标准化线虫培养基上培养，培养温度为22摄氏度。通过碱性次氯酸盐处理来生成同步发育的实验组。
wac基因缺失会降低线虫离开食物的行为，而聚集行为则不受影响
在开展行为和功能分析之前，我们使用针对野生型wac基因位点5′端、内部区域以及3′端的特异性引物组，通过基因组PCR技术验证了PHX2587中的wac基因缺失区域。在N2基因组DNA中检测到了预期的PCR产物，但在PHX2587的基因组DNA中则没有检测到相应产物，这一结果说明PHX2587线虫确实缺失了野生型wac基因对应的基因组区域（补充图1）。为确定wac基因缺失是否会影响与食物相关的社会行为，我们对相关行为进行了量化分析。
讨论
本研究结合了行为学、生理学、转录组学以及功能学分析，阐明了wac基因缺失如何影响秀丽隐杆线虫的与食物相关的行为以及胆碱能通路的功能。wac基因缺失的PHX2587线虫在离开食物的行为上出现选择性下降，而聚集行为则没有明显变化。这种选择性的行为特征表明，wac基因的缺失可能会对特定类型的、依赖于外界信号的响应行为产生不同影响，其中包括与某些特定途径相关的行为。
人工智能辅助技术声明
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CRediT作者贡献说明
Da-Woon Kim：初稿撰写、研究实施。Napissara Boonpraman：初稿撰写。Nathan C Kuhn：资源提供。Shreesh Raj Sammi：论文修订与编辑、研究指导、方法设计、资金筹集、研究构思。
未引用参考文献
版权所有 ? 1993-2026，。
伦理声明
无需获得伦理委员会的批准。秀丽隐杆线虫的相关研究通常不属于正式的IACUC或脊椎动物福利监管范畴。像线虫这类无脊椎动物一般无需遵守IACUC的相关规定。
数据可用性声明
本研究的相关数据，可在合理请求下向通讯作者获取。
资金支持
本研究得到了密歇根州立大学提供的资金支持，该资金授予了SRS。
利益冲突声明
? 作者声明自己不存在任何已知的、可能影响本论文研究结果的财务利益关系或个人关系。
致谢
这些实验用品系是由CGC提供的，而CGC则获得了美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室的资助（P40项目编号OD010440）。
Da-Woon Kim|Napissara Boonpraman|Nathan C. Kuhn|Shreesh Raj Sammi
美国密歇根州大急流城，密歇根州立大学转化神经科学系，大急流城研究中心，邮编49503
