鼻内注射胰岛素可减轻幼年大鼠新生儿缺氧缺血后的多动症样行为及神经发育缺陷

《Neurochemistry International》：Intranasal insulin reduces ADHD-like behaviors and neurodevelopmental deficits following neonatal hypoxia-ischemia in juvenile rats

　　摘要：新生儿缺氧-缺血病是导致长期神经发育障碍的主要原因，而且与注意力缺陷/多动障碍及相关行为异常的风险增加密切相关。胰岛素除了具有代谢功能外，还在发育中的大脑中发挥神经营养因子和免疫调节因子的作用。然而，早期增强中枢胰岛素信号是否能够减轻缺氧-缺血病带来的神经炎症和行为后遗症仍不清楚。本研究选取雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠，在出生后第10天进行缺氧-缺血处理（右侧颈总动脉结扎后暴露于8%氧气环境中90分钟），然后随机分为假手术+溶媒组、假手术+胰岛素组、缺氧-缺血处理+溶媒组以及缺氧-缺血处理+胰岛素组（每组12只雄性和12只雌性）。从出生后第10天到第12天，每天一次通过鼻腔给予重组人胰岛素（50 μg/天），并在出生后第21天至第25天评估其行为和组织学指标。新生儿缺氧-缺血病会导致持续的类似多动障碍的行为异常以及神经生物学方面的缺陷。值得注意的是，不同性别表现出不同的反应：雄性在注意力不集中、空间工作记忆、冲动行为、适应性社会发展、髓鞘形成及血管生成方面存在更严重的缺陷，而雌性则表现出更为明显的重复性及强迫性行为。鼻腔给予重组人胰岛素可显著改善缺氧-缺血病引发的行为缺陷，使扣带回白质中的髓鞘形成程度提高64%，海马区树突标记物表达增加56%，星形胶质细胞数量减少70%，表明该疗法能够抑制慢性星形胶质细胞炎症反应。此外，鼻腔给予重组人胰岛素还能使脑部血管容积增加49%，通过微型计算机断层扫描检测，血管直径也趋于正常，说明其有助于提升神经血管的完整性。虽然先前的研究已表明鼻腔给予重组人胰岛素可以减轻新生儿缺氧-缺血病后的急性脑损伤、神经元凋亡以及短期感觉运动功能障碍，但其对长期神经发育结果的影响仍不明确。本研究通过评估出生后第25天之前的行为及神经生物学指标，包括类似多动障碍的行为、社交缺陷、重复性行为、白质结构、星形胶质细胞增生情况、脑部血管发育状况以及不同性别的治疗反应，填补了这一知识空白。总体而言，这些研究结果表明中枢胰岛素信号是调控缺氧-缺血病后神经免疫反应及神经发育进程的关键因素，也为采用鼻腔胰岛素作为微创治疗方法、减轻新生儿脑损伤的长期神经行为后遗症提供了依据。

引言：新生儿缺氧-缺血病是导致长期神经发育问题的重要原因，其影响不仅限于运动功能障碍，还包括认知、行为及精神方面的缺陷（Millar等人，2017年）。围产期窒息是由于氧气供应不足和脑血流量下降共同作用导致的，这会使尚未成熟的脑组织缺乏氧气及必要的代谢物质（Mota-Rojas等人，2022年）。在动物模型中，如果不能及时纠正这种能量短缺状况，就会导致氧化磷酸化过程受抑、脑组织对葡萄糖的利用出现紊乱，进而引发神经元损伤和死亡（Landucci等人，2022年；Pedroza-García等人，2022年；Vannucci等人，1994年）。尽管新生儿护理水平有所提高，包括采用治疗性低温措施，但许多新生儿缺氧-缺血病幸存者仍然存在长期的神经发育缺陷，这凸显出有必要采取超出急性损伤阶段之外的干预措施（Christoffel和Mulkey，2025年；Tetorou等人，2021年）。越来越多的临床和流行病学证据表明，有围产期缺氧-缺血病史的儿童患注意力缺陷/多动障碍及相关神经行为疾病的风险更高（Bitsko等人，2024年；Giannopoulou等人，2018年）。围产期缺氧-缺血病引发的与多动障碍相关的表现包括多动、冲动、执行功能受损以及社交行为异常，这说明早期脑损伤会扰乱与注意力控制及行为调节相关的神经回路（Bitsko等人，2024年；Smith等人，2016年）。胰岛素受体在前额叶皮层（Kleinridders等人，2014年）、海马体（Spinelli等人，2019年）以及纹状体（Patel等人，2023年）等负责调节注意力、冲动控制、奖励处理及执行功能的神经网络中高度表达。此外，胰岛素信号传导异常与多巴胺神经传递受阻及执行功能障碍有关，而这些通路正是多动障碍发病机制中的关键环节（MacDonald等人，2024年）。不过，新生儿缺氧-缺血病与后期类似多动障碍的表现之间的生物学机制尚未完全明确，目前也缺乏能够有效改善长期行为后遗症的针对性治疗手段。

越来越多的研究表明，持续性神经炎症是新生儿缺氧-缺血病后导致不良神经发育结局的重要因素。在神经回路形成的关键时期，尚未成熟的脑组织对炎症信号极为敏感，星形胶质细胞和小胶质细胞的持续活化会引发突触及白质功能的长期紊乱（Millar等人，2017年；Fan等人，2006年）。白质损伤是新生儿缺氧-缺血病的典型特征，这是因为少突胶质细胞前体细胞对缺氧-缺血损伤及炎症刺激尤为脆弱（Back，2017年）。少突胶质细胞成熟受阻及髓鞘形成异常与注意力、执行功能及行为调节方面的长期缺陷密切相关（Motavaf和Piao，2021年）。与此同时，包括对皮质回路发育至关重要的板下神经元在内的易损神经元群体的丢失，会进一步阻碍新生儿缺氧-缺血病后的神经网络成熟（Kanold，2009年；Mikhailova等人，2017年）。还有新证据表明，脑部血管功能异常也是新生儿缺氧-缺血病后持续损伤及恢复迟缓的重要原因（Disdier和Stonestreet，2020年）。急性损伤阶段过后，脑血流量依然会下降，能量代谢也会发生改变，这些状况会限制髓鞘形成、突触发育及修复所需的营养物质供应（Landucci等人，2022年；Pedroza-García等人，2022年；Vannucci等人，1994年；Qin等人，2022年；Dhillon等人，2022年）。因此，神经血管功能异常可能会加剧炎症反应和代谢压力，从而为新生儿缺氧-缺血病与后期神经行为功能障碍之间提供另一条关联机制（Duran-Carabali等人，2021年）。由于新生儿缺氧-缺血病后会同时出现神经血管功能异常、神经炎症以及神经元成熟受阻等情况，那些能够同时针对这些问题的疗法有望带来持久的神经发育益处。

胰岛素越来越被视为一种具有多种功能的信号分子，它在脑发育中的作用远远超出了传统的代谢功能范畴。在中枢神经系统里，胰岛素能够调节神经元存活、突触可塑性、神经营养因子的表达、髓鞘形成、血管生成以及免疫反应（Duarte等人，2012年；Lee等人，2016年；Ferrario和Reagan，2018年）。胰岛素受体广泛存在于与注意力、执行功能、奖励处理、记忆及社交行为相关的皮质、海马体、纹状体及边缘系统区域，这说明胰岛素信号传导可能是治疗新生儿缺氧-缺血病后类似多动障碍的神经行为异常的新靶点。越来越多的证据还表明，胰岛素信号传导异常会影响多巴胺神经传递及执行功能，进而影响动机、奖励处理、工作记忆及目标导向行为（Klein等人，2018年）。此外，胰岛素信号传导还能调节神经干细胞的分化以及神经营养因子受体的表达（Langhnoja等人，2025年）。重要的是，缺氧-缺血损伤会改变发育中大脑的胰岛素样生长因子信号传导，这表明与胰岛素相关的信号通路会对代谢压力及损伤作出反应（Lee等人，1996年）。

鼻腔给药是一种微创方法，能够将胰岛素直接输送到大脑，既绕过了血脑屏障，又能最大程度降低全身低血糖风险（Fan等人，2019年；Talati等人，2024年）。鼻腔给予的胰岛素可以迅速分布到大脑的多个区域，并已在成人脑损伤及神经退行性疾病的临床前模型中展现出神经保护、抗炎以及改善认知功能的作用（Duarte等人，2012年；Lee等人，2016年；Pang等人，2016年）。虽然先前的研究已经证明鼻腔给予胰岛素可以减轻新生儿缺氧-缺血病后的急性脑损伤、神经元凋亡以及短期感觉运动功能障碍，但它对长期神经发育结果的影响仍不明确。而且，新生儿脑损伤的易感性以及多动障碍的患病率和表现存在性别差异，这也凸显出评估不同性别对治疗的反应的重要性。因此，本研究旨在探讨在生命早期通过鼻腔给予胰岛素是否能够影响新生儿缺氧-缺血病后的长期神经免疫、神经血管及行为结局。

在本研究中，我们提出了这样一个假设：在新生儿缺氧-缺血病发生后早期通过鼻腔给予胰岛素，可以减轻后续出现的类似多动障碍的行为表现及神经病理学并发症。我们利用成熟的新生儿大鼠模型，检测了与多动障碍相关的行为指标，同时还分析了神经炎症、白质结构、神经元结构以及脑部血管发育等方面的指标，研究对象包括雄性和雌性大鼠。通过结合行为学、细胞学及血管学分析，本研究旨在确定中枢胰岛素信号传导是一条可调控的途径，它将新生儿脑损伤与长期的神经发育功能障碍联系在一起。

化学品：除特别说明外，所有使用的化学品均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma公司。重组人胰岛素购自美国马萨诸塞州纽伯里波特的Cell Sciences公司。用于检测人胰岛素的蛋白质裂解缓冲液以及ELISA试剂盒分别购自美国马萨诸塞州比勒里卡的Millipore公司和新罕布什尔州塞勒姆的Alpco公司。用于检测髓鞘碱性蛋白和胶质纤维酸性蛋白的单克隆小鼠抗体，以及用于检测相关目标的多克隆兔抗体也分别来自相应公司。

鼻腔给予的重组人胰岛素可进入新生儿大脑：为了确认鼻腔给药后药物能否穿透组织，我们在给药后15分钟、1小时和4小时时检测了大脑和脊髓中重组人胰岛素的分布情况（见表1和图2）。鼻腔给予重组人胰岛素并未引起体温的明显变化，也没有导致低血糖现象。大多数幼鼠的体温保持在33.78 ± 0.14 °C，血糖水平为126.33 ± 3.17 mg/dl。在脊髓以及大脑的多个区域都检测到了重组人胰岛素的存在。

讨论：本研究表明，在缺氧-缺血病发生后早期通过鼻腔给予短时间剂量的重组人胰岛素，能够带来持久的行为、结构及血管功能改善，且这种改善效应可延续到幼年期。这些发现扩展了之前关于该药物具有急性神经保护作用的现有研究结果，同时也表明重组人胰岛素可能会影响新生儿脑损伤后的长期神经发育进程（Talati等人，2026年）。我们证实，通过鼻腔给予的重组人胰岛素确实能够到达目标部位。

CRediT作者贡献声明：Almia S Valentine：研究工作；Carolyn K Glendye：写作——审稿与编辑、研究工作；Lu-Tai Tien：写作——审稿与编辑、方法学研究；Susana M Salazar Marocho：写作——审稿与编辑、方法学研究；Nilesh Dankhara：撰写初稿、方法学研究、研究工作、正式分析、概念构建；Alexandre A da Silva：方法学研究；Jonathan W Lee：写作——审稿与编辑、研究工作；Yi Pang：写作——审稿与编辑、研究工作；Norma B Ojeda：写作——

未引用参考文献：Sousa等人，2022年；Durán-Carabali等人，2021年；Klein等人，2019年；Li等人，2025年；Nunes等人，2025年；Pal等人，2023年。

伦理声明：本研究是按照以下动物福利及/或报告相关指南开展的：《实验动物护理和使用指南》第八版（华盛顿特区：美国国家科学院出版社）。该研究已获得密西西比大学医学中心动物护理与使用委员会的批准（批准编号为2024-1384）。

伦理审批声明：所有动物护理相关操作均遵循美国国立卫生研究院制定的《实验动物护理和使用指南》要求，并已获得密西西比大学医学中心动物护理与使用委员会的批准。

数据可用性：数据将应请求提供。

利益冲突声明：作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Lir-Wan Fan和Abhay Bhatt拥有专利号#US 11,931,403 B2，名称为“用于治疗或减轻新生儿缺氧-缺血引起的脑损伤及神经行为功能障碍的组合物、系统和方法”，该专利的申请人包括Lir-Wan Fan和Abhay Bhatt；此外他们还有一项专利申请PCT/US2025/017087（WO 2025/179292 A1），名称为“用于治疗或减轻……的组合物、系统和方法”。

致谢：本研究得到了密西西比大学医学中心儿科部门的Feldman奖（IDOG）、新生儿医学基金以及儿科研究与临床教育项目（PReCEP）的支持。

作者名单：Nilesh Dankhara|Jonathan W. Lee|Norma B. Ojeda|Michelle A. Tucci|Silu Lu|Katelyn E. Childers|Madison Klim|Tyra Z. Lockett|Almia S. Valentine|Carolyn K. Glendye|Lu-Tai Tien|Susana M. Salazar Marocho|Alexandre A. da Silva|Yi Pang|Abhay J. Bhatt|Lir-Wan Fan，所在机构为美国密西西比州杰克逊市39216号的密西西比大学医学中心儿科部门，新生儿医学科。