综述：星形胶质细胞工程

《Neuroscience Research》：Astrocyte engineering

　　

星形胶质细胞作为解剖和信号界面的独特地位。先进的遗传工具现在允许对星形胶质细胞进行日益特异性的靶向。信号工程揭示了星形胶质细胞在行为和疾病中的因果作用。近期研究指向可编程的星形胶质细胞工程。组学将为下一代星形胶质细胞工程提供设计规则。

1. 1.
   星形胶质细胞作为解剖和信号界面
   星形胶质细胞以复杂的形态铺满中枢神经系统，非常适合局部感知、整合和调节脑微环境。在灰质中，成熟的原生质性星形胶质细胞从胞体延伸出数条初级分支，进一步分为高阶细支和称为“leaflets”的薄膜状突起。这些区域小至5-10 nm，且常规标记物如GFAP无法完全捕获，因此许多星形胶质细胞功能可能依赖于难以用标准方法可视化和操作的细胞域。这些突起占据几乎不重叠的领地，侵入神经毡，并在受限的解剖区域内接触大量突触、细胞外空间和细胞伙伴。这种组织使单个星形胶质细胞能够获取局部神经元活动，同时邻近星形胶质细胞以近乎连续的方式覆盖组织。在突触处，星形胶质细胞leaflets部分包裹突触元件，使星形胶质细胞膜靠近神经递质释放和细胞外离子通量部位，支持谷氨酸摄取、递质溢出调节、细胞外K⁺缓冲和代谢支持等经典功能。星形胶质细胞通过转运体、离子通道、GPCR以及细胞内Ca²⁺或cAMP信号检测神经元活动，这种解剖结构可能使星形胶质细胞具有空间定义的行动域，精细突起设定了它们检测、整合和影响神经环路活动的尺度。相同的细胞结构还将神经元活动与脉管系统联系起来。一部分星形胶质细胞突起分化为血管周围“endfeet”，覆盖血管并参与神经血管单元。Endfeet包含专门的分子机制，包括通道、转运体、受体和支架蛋白，参与血脑屏障调节、脑血流控制、营养处理和废物清除。星形胶质细胞因此能够桥接突触活动、血管功能和组织稳态，例如在功能性充血中。除了突触和血管接触，星形胶质细胞还与邻近星形胶质细胞和其他胶质细胞通讯。间隙连接偶联主要由连接蛋白介导，允许星形胶质细胞跨细胞网络交换离子、代谢物和信号分子。这种网络组织可能将局部活动的后果扩展到单个星形胶质细胞领地之外，并有助于空间K⁺缓冲和代谢分布。星形胶质细胞还通过细胞因子、补体相关通路和炎症信号与微胶质细胞相互作用，并与少突胶质细胞谱系细胞相互作用，影响OPC行为、髓鞘形成和修复。这些相互作用在疾病中尤为重要，因为星形胶质细胞状态可随炎症、损伤、衰老或神经退行性变而改变。这些解剖和形态学安排将星形胶质细胞置于突触、血管、胶质和细胞外区室的界面。这种组织使它们能够读出局部神经活动并协调周围组织的离子、代谢、血管和炎症状态。每个解剖界面为星形胶质细胞功能调节创造了机会和限制：突触周围突起提供对局部环路信号的访问，endfeet将星形胶质细胞输出连接到血管和屏障功能，胶质接触暴露炎症和髓鞘相关线索，间隙连接网络则增加了被操纵星形胶质细胞效应可能超出初始靶细胞传播的可能性。本文采用“星形胶质细胞工程”作为框架，描述对星形胶质细胞中分子访问、信号控制和可编程细胞输出的有意设计。该框架可分为三个层次：第一是分子访问，将遗传物质放入定义的星形胶质细胞群体中；第二是信号控制，改变内源性通路如GPCR、Ca²⁺、cAMP、代谢或转录反应；第三是可编程细胞工程，添加合成传感或效应模块，使星形胶质细胞响应定义的微环境线索执行选定的输出。这种区分很有用，因为并非所有星形胶质细胞操作具有相同的设计逻辑或治疗意义。
2. 2.
   访问工程
   2.1. 靶向星形胶质细胞
   对星形胶质细胞进行基因工程的能力首先取决于可靠的分子访问。这比选择单一星形胶质细胞标记物更困难，因为星形胶质细胞相关基因在其覆盖度、特异性、发育历史和状态依赖性方面存在差异。标记物如Gfap、Slc1a3、Aqp4和Gjb6可在转基因小鼠品系中提供对部分重叠星形胶质细胞群体的访问，而基于Aldh1l1的策略通常提供全星形胶质细胞覆盖，特别适用于全星形胶质细胞标记、监测和基因操作。一些Cre驱动子的发育表达可能标记祖细胞衍生谱系或非星形胶质细胞。相反，诱导型Cre系统提供时间和交集控制，但他莫昔芬依赖性重组在不同动物性别、脑区和疾病状态间存在差异。腺相关病毒（AAV）载体使快速星形胶质细胞分子访问变得可行，但其使用引入了额外变量。不同AAV血清型和工程化衣壳具有不同的趋向性，且随递送途径、物种和解剖区域而变化。基于GFAP的启动子，包括最小GfaABC1D启动子，因其小尺寸和与AAV载体的兼容性而被广泛使用。GfaABC1D支持了许多星形胶质细胞标记、钙成像和功能操作研究。在这些应用中，适度的脱靶表达可能不总是功能限制性的，特别是当载体是报告基因、指示剂或执行器时，需要足够的表达水平、细胞定位或多个功能拷贝才能影响测量输出。然而，当载体是催化性或基于重组酶的，相同程度的启动子渗漏可能成为问题。因此，脱靶表达的功能后果不仅取决于启动子、血清型、剂量和递送途径，还取决于所递送的载体。克服仅启动子靶向限制的一个重要近期方法是miRNA去靶向。Gleichman及其同事开发了4x6T盒，包含多个miRNA靶序列，可减少脱靶神经元和内皮细胞中的转基因表达，同时在星形胶质细胞中保持表达。当与GfaABC1D结合时，该策略显著改善了跨多种AAV血清型和载体（包括重组酶和报告基因）的星形胶质细胞特异性。概念上的进步是通过结合星形胶质细胞中的正靶向和不需要的细胞类型中的转录后抑制来实现特异性。更广泛地说，细胞类型特异性miRNA谱为设计遗传回路提供了逻辑，其中内源性转录后调控有助于细胞特异性。

2.2. 靶向多样化的星形胶质细胞状态

星形胶质细胞现在最好被视为多样化的细胞群体，其身份、状态和反应随解剖和病理环境而变化。在形态、分子身份和功能上的差异在脑区、发育阶段、灰质和白质区室以及疾病状态中都很明显。区域特异性转录谱、间隙连接偶联的差异以及支持局部神经元群体的不同能力表明，星形胶质细胞受其所在环路塑造。疾病相关或反应性星形胶质细胞状态增加了进一步的复杂性，因为损伤或炎症可改变基因表达、形态和启动子活性。这种多样性对遗传靶向星形胶质细胞具有直接意义。被描述为星形胶质细胞特异性的工具可能不会均等地靶向所有星形胶质细胞，也不一定在脑区、物种或疾病状态中以相同方式起作用。相反，统一靶向所有星形胶质细胞可能是不可取的，如果目标是修改定义的环路、血管微环境或病理微环境。星形胶质细胞工程因此需要区分细胞类型靶向和状态靶向。细胞类型靶向询问转基因是否限于星形胶质细胞；状态靶向询问哪些星形胶质细胞被访问，在哪个区域、哪个疾病阶段和哪种分子条件下。这种区分指向需要分子图谱来连接星形胶质细胞身份、状态和解剖位置。单细胞和单核转录组学可定义星形胶质细胞群体和疾病相关状态，而空间转录组学保留其组织背景。染色质可及性和增强子图谱可能揭示用于状态或区域偏向访问的调控元件，蛋白质组学或表面组学方法可能识别RNA单独无法捕获的分子特征。这些方法不替代功能验证，但为选择靶向哪些星形胶质细胞、使用哪种调控逻辑以及工程化哪种输出提供了框架。因此，星形胶质细胞的分子访问应被视为一个设计问题：目标不仅仅是表达转基因于星形胶质细胞中，而是在适当的组织背景中以适当的控制水平访问适当的星形胶质细胞群体。

1. 3.
   信号工程
   分子访问为星形胶质细胞工程提供了入口，下一个问题是一旦实现访问应该操纵什么。当前方法分为两大类：一类是干扰星形胶质细胞中的基因或调控程序，允许对定义分子通路进行功能缺失或功能获得研究；另一类是干扰星形胶质细胞信号，允许研究人员改变将星形胶质细胞与环路和组织状态联系起来的Ca²⁺、GPCR、cAMP、代谢或转录反应。这些策略是互补的。

3.1. 基因操作

病毒载体可递送Cre、Flp、显性负性构建体、shRNA、CRISPR组件或转录调节因子到选定脑区，或通过适当衣壳递送到更广泛的CNS区域。这些方法允许在星形胶质细胞中删除、激活、抑制或正交开启基因。Cas9介导的靶向基因编辑可选择地在星形胶质细胞中破坏编码序列。AAV兼容系统，包括最近的体内基因组操作平台如GEARBOCS，为成年大脑中可扩展的星形胶质细胞扰动提供了途径。这些工具对星形胶质细胞工程具有吸引力，因为许多星形胶质细胞表型通常由基因网络控制。这些系统可提供许多星形胶质细胞通路的功能缺失或功能获得访问，但其时间逻辑需要谨慎。组成型Cre或Flp驱动子可产生终身重组，使重组历史难以与成年星形胶质细胞特异性分离。诱导型CreERT2系统通过增加时间控制减少了这个问题，但重组效率和特异性仍需要在所研究的组织状态中验证。未来的星形胶质细胞基因编辑也可能受益于可逆或自限性重组酶策略，例如Cre或Flp活性可在所需遗传开关发生后失活。

3.2. 信号操作

概念上的转变是从星形胶质细胞特异性基因删除到星形胶质细胞特异性程序控制。这需要仔细定义星形胶质细胞“活动”。神经元活动通常被动作电位发放和快速突触传递操作定义，可通过电生理学或光学活动指示剂探测。星形胶质细胞活动没有映射到单一等效输出。星形胶质细胞通过GPCRs、转运体、离子通道和细胞内第二信使响应神经递质、神经调质、细胞外离子、代谢物和炎症线索。这些信号在多个尺度上展开：它们可发生在精细突起、胞体、endfeet或间隙连接偶联的星形胶质细胞网络中；可持续数秒至数分钟；并可参与更持久的代谢、转录或炎症状态。这种多尺度组织使星形胶质细胞信号难以解释，但也提供了多个工程入口。其中，GPCR信号是一个核心控制点。星形胶质细胞表达许多神经递质和神经调质受体，包括谷氨酸、GABA、乙酰胆碱、去甲肾上腺素、多巴胺、血清素、ATP、腺苷和神经肽。这些受体偶联Gq、Gi/o或Gs通路，允许星形胶质细胞将局部神经元和神经调质活动转化为Ca²⁺、cAMP、代谢和转录反应。近期工作将星形胶质细胞GPCR信号定位为状态依赖性响应性的门控：相同的星形胶质细胞可能根据区域、行为状态、神经调质张力和先前经验做出不同响应。化学遗传学方法提供了一种功能获得策略。星形胶质细胞表达Gq、Gi或Gs偶联的DREADDs已被用于激活定义的GPCR通路，改变Ca²⁺信号、星形胶质细胞分子或代谢状态、神经元兴奋性、环路可塑性和行为。星形胶质细胞Ca²⁺信号是最广泛操纵的第二信使通路。Ca²⁺信号发生在胞体、突起、突触周围域和血管endfeet中，其空间组织很重要。体块Ca²⁺测量不能捕获所有相关的微域Ca²⁺活动。基于表达hPMCA2w/b（一种人质膜Ca²⁺ ATP酶变体）的CalEx已通过病毒载体或CalEx floxed小鼠递送，用于局部和广泛CNS区域降低细胞内Ca²⁺信号。通路特异性抑制提供了另一层次的控制。iβARK策略通过使用源自β-肾上腺素受体激酶1的短抑制肽，在不引起广泛基因表达变化的情况下减弱星形胶质细胞Gq-GPCR信号。DREADDs、CalEx和iβARK说明了三种互补的工程逻辑，不应被视为可互换的“激活”或“沉默”星形胶质细胞的方法。

3.3. 星形胶质细胞信号操作对疾病修饰的效应

星形胶质细胞工程的一个中心目标是测试数据驱动的利用改变的星形胶质细胞通路是否可以修饰病理性脑状态。阿尔茨海默病说明了星形胶质细胞定向干预的前景和未解决的特异性。星形胶质细胞Ca²⁺信号在淀粉样蛋白模型中改变，包括斑块相关星形胶质细胞Ca²⁺过度活动和细胞间Ca²⁺波。在AppNL-F小鼠中，扣带皮层中星形胶质细胞Ca²⁺信号降低已被因果地联系到早期神经元过度活动、改变的功能连接、癫痫发作易感性和昼夜行为破坏。亨廷顿病提供了背景依赖性星形胶质细胞干预的有用例子。纹状体星形胶质细胞在小鼠模型和人类组织中显示疾病阶段特异性分子和功能变化。降低突变型亨廷顿蛋白可逆转大多数核心疾病相关基因表达变化。Gi偶联星形胶质细胞信号提供了疾病相关通路控制的第二个例子。在健康纹状体中，星形胶质细胞Gi通路激活诱导涉及血小板反应蛋白-1的突触生成程序，增加中等多棘神经元兴奋性并改变行为。在亨廷顿病模型中，这种信号逻辑可通过已被突变型亨廷顿蛋白重塑的纹状体星形胶质细胞状态来解释。星形胶质细胞Gi激活因此可揭示和利用疾病相关环路背景中的潜在支持程序。

1. 4.
   可编程星形胶质细胞工程
   上述方法操纵内源性星形胶质细胞基因或信号通路。进一步步骤是将星形胶质细胞工程化为可编程细胞。在这种设计逻辑中，星形胶质细胞被赋予新的识别模块、新的效应模块或新的感测与行动之间的联系。目标不再局限于标记星形胶质细胞、删除基因或偏向信号通路，而是构建检测定义分子或细胞输入并在局部脑组织中执行选定输出的星形胶质细胞。

4.1. 星形胶质细胞作为可编程传感器-效应细胞

CAR-星形胶质细胞（CAR-A）提供了一个最近的例子，将星形胶质细胞操纵从实验者触发控制转向输入门控的细胞行为。在CAR-A研究中，抗Aβ单链抗体融合到吞噬受体衍生的胞内结构域，包括MEGF10或Dectin-1基模块，以将Aβ识别与星形胶质细胞介导的摄取和降解联系起来。在培养的星形胶质细胞中，CAR-A表达增强了Aβ42寡聚物摄取和降解。在5xFAD小鼠中，CAR-A构建体的全身递送在预防性和治疗性范式中减少了淀粉样蛋白负荷和相关病理。单核RNA测序进一步显示CAR-A治疗后星形胶质细胞和微胶质细胞状态的协调变化。第二个设计逻辑由基于synNotch的系统提供。Notch是介导接触依赖性细胞-细胞通讯的膜受体。合成Notch（synNotch）保留了这种模块化结构，但用用户定义的识别模块替换了天然胞外配体结合域，并用选择的转录因子替换了天然胞内域。对于星形胶质细胞，synNotch逻辑的优势在于检测局部组织线索可转化为空间受限的星形胶质细胞输出，例如营养支持、抗炎信号或报告蛋白分泌。在培养的星形胶质细胞中，双识别synNotch系统已用于通过结合磷脂酰丝氨酸识别和神经元神经节苷脂Gt1b识别来检测神经元凋亡，重建了仅当两种线索都存在时才产生转录输出的AND门设计。疾病响应性合成基因回路增加了相关方向。在这些设计中，疾病相关分子可被视为输入而不仅仅是清除的底物。蛋白质聚集体如Aβ、细胞碎片、凋亡膜信号、细胞表面分子、ECM成分以及血管或炎症微环境线索原则上均可用于门控星形胶质细胞输出。

4.2. 星形胶质细胞作为环路雕刻师：工程化trogocytosis

星形胶质细胞也提供了结构环路工程的途径。内源性星形胶质细胞通过包括MEGF10、MERTK和其他吞噬相关机制在内的通路参与突触消除、突触重塑和吞噬清除。工程化可将这些过程转化为定向环路重塑的工具。最近，一种合成trogocytosis系统SynTrogo使用工程化神经元-星形胶质细胞识别来诱导星形胶质细胞介导的神经元膜或突触物质摄取。互补的配体-受体模块使定义的神经元和星形胶质细胞群体进入物理相互作用，在轴突-星形胶质细胞界面产生超微结构变化并减少靶向环路中的突触连接。这种方法将星形胶质细胞工程扩展到信号控制之外；星形胶质细胞充当可编辑局部环路结构的细胞。然而，突触去除是一个强大的效应输出，其可逆性有限。

4.3. 星形胶质细胞作为生长因子工厂和微环境构建者

第三种星形胶质细胞细胞工程形式使用星形胶质细胞作为局部支持来源。它利用星形胶质细胞提供持续的营养、代谢、抗炎或微环境构建输出。GFAP启动子驱动的BDNF表达是一个早期例子，其中星形胶质细胞被转化为持续局部神经营养支持的来源。反应性星形胶质增生增加了GFAP启动子活性，产生损伤相关BDNF生产增强。星形胶质细胞衍生的BDNF保护选定的纹状体神经元群体免受喹啉酸诱导的兴奋性毒性，并改善行为结果。一个相关的作用是用于细胞治疗的微环境构建。在帕金森病模型中，共同移植星形胶质细胞与神经祖细胞改善了多巴胺能神经元的植入、成熟和长期存活。中脑衍生的星形胶质细胞比皮质星形胶质细胞更有效地支持多巴胺能神经元结果，表明星形胶质细胞起源区域可影响支持性能。用Nurr1和Foxa2工程化供体星形胶质细胞进一步增强了神经营养支持和功能恢复。在这种设计中，工程化星形胶质细胞不替代丢失的多巴胺能神经元，而是创建一个支持移植神经元细胞的局部环境。

1. 5.
   挑战与展望
   星形胶质细胞工程将随着分子图谱与功能扰动整合而进步。分子图谱意味着星形胶质细胞状态的空间和功能注释描述，包括基因表达、染色质状态、受体和信号分子表达、解剖位置以及微环境关联。主要原因是星形胶质细胞不是均匀靶标。它们的形态、基因表达、染色质状态、分泌组和功能在脑区、发育阶段、灰质和白质、血管和突触微环境、疾病阶段和物种间变化。启动子、受体、抗原或效应器在一种星形胶质细胞状态下有效，在另一种状态下可能失败或表现不同。组学可以帮助将这种复杂性转化为设计信息。单细胞和单核转录组学定义星形胶质细胞群体和疾病相关状态。空间转录组学将这些状态置于组织背景中。染色质可及性和增强子图谱可识别用于状态或区域偏向表达的调控元件。蛋白质组学、分泌组学和表面组学可揭示候选CAR抗原、synNotch配体、分泌效应器和细胞外基质特征。代谢组学和同位素示踪可识别乳酸处理、糖原利用、氧化还原控制或神经元-星形胶质细胞代谢偶联的代谢模块。组学数据本身不会定义星形胶质细胞工程规则，其主要价值是提名候选访问元件、传感输入和效应通路，然后可在定义的背景中进行扰动测试。这样的分子和生理数据集可被视为工程资源而非描述性目录。它们可为三个核心模块提供信息：访问、传感、效应输出。第四层，时空控制，约束程序在何处、何时以及持续多久运行。这可通过药物诱导表达系统如Tet-On/Tet-Off或CreERT2、局部递送和细胞类型限制性AAV设计、组合逻辑如基于synNotch的AND门以及传感器和效应器的亚细胞靶向或锚定来实现。星形胶质细胞工程仍处于早期阶段。其中心抱负是通过利用快速扩展的关于星形胶质细胞身份、状态和响应的分子知识，使定义的星形胶质细胞功能在适当的细胞和组织背景中可控。因为星形胶质细胞位于突触、血管、胶质和细胞外界面，它们非常适合感知局部脑状态并提供空间匹配的输出。下一个挑战是将这种界面生物学转化为可控设计，以改善脑功能，同时不损害使星形胶质细胞成为有吸引力靶标的稳态作用。