《Journal of Extracellular Vesicles》：Vesicle Nucleation Peptide Fusion Induced Extracellular Vesicles Are Distinct From Escherichia coli Outer Membrane Vesicles, and Provide an Enhanced Platform for Protein Production and Purification
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细菌外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌释放的纳米级球形结构，在细菌生理学中发挥多种作用，包括通讯、营养获取和宿主相互作用。这些囊泡从细菌外膜出芽，含有脂多糖、周质蛋白、核苷酸和其他生物分子。囊泡成核肽（VNp）是一个短肽标签，当与目标蛋白的氨基端融合时，促进大
细菌外膜囊泡（OMVs）是革兰氏阴性菌释放的纳米级球形结构，在细菌生理学中发挥多种作用，包括通讯、营养获取和宿主相互作用。这些囊泡从细菌外膜出芽，含有脂多糖、周质蛋白、核苷酸和其他生物分子。囊泡成核肽（VNp）是一个短肽标签，当与目标蛋白的氨基端融合时，促进大肠杆菌中定制重组细胞外囊泡（EVs）的形成，从而实现重组蛋白的高效生产和简化纯化。本研究对VNp诱导的细胞外囊泡（VNp-EVs）进行了表征，并将其与表达周质靶向融合蛋白的大肠杆菌产生的OMVs进行了组成和组织的比较。虽然两种囊泡类型都具有单一外膜来源的脂质双层，但与含有周质靶向ssDsbA融合蛋白的OMVs相比，重组蛋白在VNp-EVs中高度富集。VNp融合蛋白和周质靶向重组蛋白定位于不同的囊泡群体，与含有周质靶向融合蛋白的囊泡相比，VNp融合蛋白显示出显著更高的腔内浓度和相对囊泡丰度。OmpX共表达进一步富集了囊泡中的VNp融合蛋白含量，进一步提高了产量。VNp-囊泡腔体是一个氧化环境，因此支持包封蛋白内分子间和分子内二硫键的形成。总体而言，VNp-EVs代表了一类独特的重组EVs，为生产和纯化浓缩、正确折叠的重组蛋白提供了一条简单高效的途径，扩展了细菌囊泡系统在生物技术应用中的实用性。
**论文解读：囊泡成核肽融合诱导的细胞外囊泡与大肠杆菌外膜囊泡的差异及其在蛋白质生产与纯化中的增强平台**
**研究背景**
革兰氏阴性菌能够释放外膜囊泡（OMVs），这些纳米级囊泡由外膜出芽形成，含有脂多糖（LPS）、周质蛋白、核酸等成分，在细菌通讯、营养获取、致病性及免疫逃逸中发挥关键作用。传统上，重组蛋白的生产常利用大肠杆菌周质靶向信号肽（如ssDsbA）将蛋白导入周质，再通过OMVs分泌，但存在产量低、纯度不足、蛋白折叠受限等问题。囊泡成核肽（VNp）技术是新近发展的方法：将源自人突触核蛋白的短肽标签（VNp）融合至目标蛋白氨基端，可诱导大肠杆菌形成重组细胞外囊泡（EVs），实现蛋白的高效胞外分泌和简化纯化。然而，VNp诱导的EVs（VNp-EVs）与天然OMVs在生物物理性质、形成机制及蛋白包装效率上的差异尚不清楚。本研究旨在深入表征VNp-EVs的组成与组织，阐明其与OMVs的异同，为技术优化和生物技术应用提供依据。论文发表在《Journal of Extracellular Vesicles》。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键方法：（1）动态光散射（DLS）测定囊泡尺寸与多分散性；（2）透射电子显微镜（TEM）薄切片和冷冻电子显微镜（Cryo-EM）观察囊泡膜结构；（3）结构光照明显微镜（SIM）和荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析囊泡内蛋白定位、浓度、各向异性及粘度；（4）薄层色谱（TLC）和核磁共振（NMR）分析磷脂组成；（5）使用氧化还原生物传感器FROG/B评估囊泡腔氧化还原环境；（6）通过SDS-PAGE和Western blot比较蛋白丰度。样本来源为BL21 Star (DE3) *E. coli* 菌株，表达VNp6-mCherry2（mCh2）或ssDsbA-mCh2融合蛋白，部分实验共表达外膜蛋白OmpX-mNeongreen（mNG）。
**研究结果**
**3.1 VNp-EVs同时含有腔内蛋白和膜蛋白，并通过与OMVs不同的机制产生**
SIM成像显示，共表达VNp6-mCh2与OmpX-mNG时，大部分VNp-mCh2信号位于OmpX-mNG标记的囊泡内（>95%），但仅不到一半的OmpX-mNG囊泡含有VNp-mCh2，而ssDsbA-mCh2几乎存在于所有OmpX-mNG囊泡中。当同时表达ssDsbA-mCh2和VNp-mNG时，两种荧光信号从未在同一囊泡中重叠，表明VNp-EVs和ssDsbA-OMVs属于不同的囊泡群体。FLIM各向异性测量表明，VNp融合蛋白在腔内为可溶性单体（各向异性0.312 ± 0.025 mA），而OmpX-mNG整合于膜中（0.203 ± 0.04 mA），ssDsbA融合蛋白则在囊泡中呈现二聚体状态（0.229 ± 0.081 mA）。
**3.2 VNp-EVs和OMVs均源自大肠杆菌外膜，尺寸相当**
TLC和NMR分析显示，VNp-EVs和ssDsbA-OMVs的磷脂组成相似，均以磷脂酰乙醇胺（PE）为主（约80%），含磷脂酰甘油（PG）和心磷脂（CL），且含有脂质A（LPS），证实其膜起源于外膜。DLS测定表明，VNp-EVs平均直径163 ± 2.5 nm，ssDsbA-OMVs为144 ± 2.6 nm，两者均呈单分散（多分散指数<0.1）。TEM和Cryo-EM显示，两种囊泡均为单层脂质双层（厚约5 nm），约5%的VNp-EVs含多层膜。氧化还原传感器FROG/B实验表明，VNp-EVs的腔体为氧化环境，与周质来源一致，且RADA染色（肽聚糖染料）在VNp囊泡中未检出，说明囊泡不含肽聚糖。
**3.3 VNp融合蛋白的囊泡产量显著高于ssDsbA融合蛋白**
通过测量培养基中mCh2的吸光度（589 nm），研究人员发现VNp6-mCh2的胞外产量为298 ± 70 mg/L，而ssDsbA-mCh2仅为42 ± 4 mg/L。共表达OmpX-mNG可进一步提高VNp融合蛋白产量至约13.26 μM（培养基中mCh2浓度），而ssDsbA组无显著变化。SDS-PAGE分析显示，VNp融合蛋白占囊泡总蛋白含量的平均76%，而ssDsbA融合蛋白仅占37%。共表达OmpX后，VNp融合蛋白占比升至85%。
**3.4 VNp融合蛋白的腔内浓度高于ssDsbA融合蛋白**
FLIM定量测定囊泡内mCh2浓度：ssDsbA-mCh2为5 ± 0.72 μM，VNp6-mCh2为7.2 ± 0.83 μM，VNp6-mCh2 + OmpX为9.3 ± 1.3 μM。同时，囊泡粘度随融合蛋白浓度增加而降低（ssDsbA组8.093 cP，VNp组7.677 cP，VNp+OmpX组6.489 cP），表明蛋白含量越高，腔内环境越粘稠。此外，研究人员测试了不同大小的VNp融合蛋白（VNp-mCh2-StefinA 43.4 kDa，VNp-mCh2-Uricase 66.8 kDa），发现腔内浓度与蛋白大小呈负相关，说明较大蛋白可能难以有效穿越肽聚糖层。
**讨论与结论**
讨论部分指出，VNp-EVs与ssDsbA-OMVs在形成机制上存在本质区别：VNp融合蛋白与ssDsbA融合蛋白互不共存于同一囊泡，表明VNp诱导的囊泡形成并非简单的周质肿胀，而是由VNp驱动的定向成核过程。研究人员提出，VNp融合蛋白可能通过SRP途径（信号识别颗粒途径）转运至周质，随后扩散穿过肽聚糖层（若分子量≤50 kDa），与外膜相互作用并诱导外膜弯曲出芽；若无法穿过肽聚糖，则可能形成细胞内囊泡。SIM活细胞成像显示，囊泡主要形成于细胞极点和分裂位点，这些区域膜脂质组成、曲率和周质宽度不同，有利于囊泡快速形成。OmpX共表达增强了VNp融合蛋白的包装效率和膜稳定性，但未改变囊泡尺寸。
**研究结论**（翻译原文结论部分）：
总之，VNp-EVs代表了一类与OMVs不同的重组EVs，为生产高产量、相对纯度高、浓缩且功能正确的囊泡包被重组蛋白提供了一条简单高效的途径，可应用于工业酶生产和生物技术领域。此外，由于VNp囊泡已被确认含有脂质A，其在疫苗递送方面具有令人兴奋的潜力。
