薯蓣皂苷元通过抑制基质金属蛋白酶-9驱动的TGF-β/Smad2/3信号增强移植的人少突胶质前体细胞介导的早产儿白质损伤髓鞘形成

《Neurotherapeutics》：Diosgenin enhances transplanted human oligodendrocyte precursor cell-mediated myelination in preterm white matter injury by inhibiting matrix metalloproteinase-9–driven TGF-β/Smad2/3 signaling

　　

早产儿白质损伤（PWMI）是长期运动及认知功能障碍的主要原因，目前尚无直接促进少突胶质细胞谱系成熟的疗法。在此，研究人员利用早产儿白质损伤（PWMI）的缺氧缺血小鼠模型，结合体外小胶质细胞-少突胶质前体细胞（OPC）共培养系统，鉴定出天然甾体皂苷元薯蓣皂苷元是移植的人少突胶质前体细胞（hOPCs）的有效促髓鞘形成调节剂。薯蓣皂苷元能穿越血脑屏障（BBB），促进移植的hOPCs和内源性OPC分化为成髓鞘少突胶质细胞，从而加速髓鞘再生并改善神经功能。机制研究揭示，薯蓣皂苷元抑制基质金属蛋白酶-9/2（MMP-9/2）活性，这种抑制减弱了小胶质细胞和OPC中的转化生长因子β-Smad2/3（TGFβ-Smad2/3）信号，进而缓解小胶质细胞活化并上调髓鞘相关蛋白。这些发现揭示了一个先前未被识别的控制hOPC介导的髓鞘修复的MMP-9-TGFβ-Smad2/3轴，并将薯蓣皂苷元确立为一种有前景的辅助治疗剂，用于基于细胞的针对PWMI及其他白质疾病的策略。

**论文解读：薯蓣皂苷元通过抑制MMP-9驱动的TGF-β/Smad2/3信号增强移植的人少突胶质前体细胞介导的早产儿白质损伤髓鞘形成**

**研究背景**
早产儿白质损伤（PWMI）是导致长期运动及认知功能障碍（如脑瘫、运动缺陷、认知障碍）的主要原因。缺氧缺血（HI）、炎症及其他多种因素参与了PWMI的进展。在髓鞘形成过程中，少突胶质前体细胞（OPC）需要极高的能量供应以分化为成髓鞘少突胶质细胞并合成髓鞘脂质。由于OPC对能量衰竭的耐受性低，即使是轻微的缺血事件也可对其造成显著损伤，因此OPC的耗竭或其后续分化失败被认为是PWMI中髓鞘形成不足的关键原因。虽然治疗性低温是足月新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的标准疗法，但获益婴儿不足20%，多数仍存在长期残疾。基于细胞的疗法通过提供营养支持和替代丢失细胞，被认为是新生儿白质损伤（WMI）的有前景替代方案。然而，OPC移植的临床转化仍面临挑战，主因是WMI后炎症微环境中OPC向成熟少突胶质细胞的分化效率低下。因此，增强移植OPC的分化能力对于推进WMI的细胞疗法至关重要。薯蓣皂苷元是一种甾体皂苷元，已在多种疾病模型中显示出治疗潜力，包括促进OPC分化、减轻神经炎症和轴突变性、增强髓鞘恢复。然而，其是否能增强移植的人OPC（hOPC）在PWMI动物模型中的分化和髓鞘形成尚不清楚。转化生长因子β1（TGFβ1）信号对髓鞘形成和髓鞘完整性至关重要，其在小胶质细胞与少突胶质细胞间的紊乱会破坏髓鞘结构。基质金属蛋白酶9（MMP-9）可通过切割潜在相关肽（LAP）复合物和细胞外基质（ECM）来激活TGFβ信号，释放活性TGFβ细胞因子。本研究旨在探讨薯蓣皂苷元是否通过靶向抑制MMP-9活性来抑制TGFβ-Smad2/3信号，从而上调髓鞘相关蛋白表达并促进OPC分化。

**主要技术方法**
1. **人胚胎干细胞（HESC）来源的hOPC诱导与分化**：从HESC-H9细胞系（来源：中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所）诱导生成hOPC，并鉴定其标志物表达。
2. **PWMI小鼠模型建立与处理**：采用P3新生小鼠的缺氧缺血（HI）模型，通过结扎右侧颈总动脉并暴露于8% O₂/92% N₂ 2小时。术后7天进行hOPC纹状体移植，并口服给予薯蓣皂苷元（40或80 mg/kg）。
3. **分子机制验证**：通过分子对接、明胶酶谱法（Gelatin zymography）评估MMP-9/2活性；通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TGFβ1水平；通过Western blot和免疫荧光分析TGFβ-Smad2/3信号通路蛋白及髓鞘相关蛋白表达。
4. **行为学评估**：采用旷场实验（Open field test）和Morris水迷宫（MWM）测试评估认知功能。
5. **超微结构分析**：利用透射电子显微镜（TEM）评估髓鞘厚度和轴突髓鞘化密度。

**研究结果**
**1. Diosgenin enhanced myelination of transplanted hOPCs in a PWMI model**
通过免疫荧光染色和Western blot分析，研究证实了从H9细胞成功诱导出hOPC。在PWMI小鼠模型中，与单独移植hOPC组相比，薯蓣皂苷元（40和80 mg/kg）处理组中Flag⁺/MAG⁺双阳性细胞数和STEM121⁺/MBP⁺细胞比例显著增加，MBP平均荧光强度（MFI）升高，表明薯蓣皂苷元有效促进了移植hOPC向成熟少突胶质细胞的分化。

**2. Diosgenin enhanced the efficacy of hOPC transplantation in improving cognitive functions in PWMI mice**
行为学测试显示，与单独移植或单独给药组相比，联合治疗组小鼠在旷场实验中的总路程、中心区进入次数和停留时间显著增加，在MWM测试中，其逃避潜伏期缩短，目标象限停留时间延长，平台穿越次数增多，表明薯蓣皂苷元协同hOPC移植显著改善了PWMI小鼠的焦虑样行为和空间学习记忆能力。

**3. Diosgenin targets MMP-9 to inhibit its activity**
Western blot结果显示，HI后MMP-9表达持续升高，而组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）仅短暂上调。分子对接模拟显示，薯蓣皂苷元能与MMP-9和MMP-2形成稳定复合物，结合自由能分别为-7.3 kcal/mol和-8.1 kcal/mol。明胶酶谱法证实，薯蓣皂苷元（40和80 mg/kg）处理能显著抑制HI后MMP-2和MMP-9的酶活性，但不影响其蛋白表达水平。UPLC-MS/MS分析显示，薯蓣皂苷元可穿透血脑屏障（BBB）并在病理条件下富集于胼胝体。

**4. Diosgenin promotes myelination via MMP-9-mediated inhibition of TGFβ-Smad2/3 signaling**
ELISA和Western blot分析表明，HI激活了TGFβ-Smad2/3信号，表现为TGFβ1水平升高、p-Smad2/3上调、p21上调、cyclin D1下调、ID4上调、MYRF下调。薯蓣皂苷元处理可逆转这些变化。通过AAV过表达MMP-9或补充重组人TGFβ1（rhTGFβ1），均能抵消薯蓣皂苷元对髓鞘形成和TGFβ-Smad2/3信号的抑制效应，证实了MMP-9是介导该作用的关键靶点，且TGFβ-Smad2/3是下游信号通路。

**5. Diosgenin suppresses MMP-9 activity in LPS-induced microglia and recombinant MMP-9-treated OPCs**
体外实验表明，在脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞中，薯蓣皂苷元能显著降低MMP-9活性。在重组MMP-9处理的OPC中，薯蓣皂苷元同样抑制了MMP-9活性，证实了其直接抑制MMP-9活性的作用。

**6. Diosgenin inhibits TGFβ-Smad2/3 signaling in OPCs and microglia both in vivo and in vitro**
免疫荧光共定位显示，薯蓣皂苷元处理减少了脑组织中PDGFRα⁺/p-Smad2/3⁺和Iba-1⁺/p-Smad2/3⁺双阳性细胞数。体外条件培养基（CM）转移实验表明，经薯蓣皂苷元处理的LPS刺激BV2细胞的条件培养基，能有效逆转LPS条件培养基对hESC-OPC分化的抑制，并降低TGFβRII和p-Smad2/3的蛋白水平。

**讨论与结论**
本研究首次揭示，薯蓣皂苷元通过直接抑制MMP-9活性，进而抑制TGFβ-Smad2/3信号通路，从而显著增强移植hOPC在PWMI模型中的髓鞘形成能力并改善功能恢复。该作用机制与先前报道的薯蓣皂苷元通过雌激素受体介导的ERK1/2激活促进OPC分化不同，是一个新发现的、特异性针对MMP-9的机制。研究证实，联合hOPC移植和薯蓣皂苷元治疗可有效促进髓鞘再生、保护轴突完整性，并改善认知功能。分子层面，薯蓣皂苷元通过抑制MMP-9活性，下调TGFβ1水平，抑制下游Smad2/3磷酸化，从而调节细胞周期（p21和cyclin D1）和OPC分化关键转录因子（ID4、MYRF），促进OPC成熟。此外，薯蓣皂苷元还能调节小胶质细胞活化，为移植的hOPC和内源性OPC创造一个有利的微环境。研究结论认为，薯蓣皂苷元有效增强了hOPC移植介导的髓鞘修复和认知功能恢复，其机制是通过抑制MMP-9活性并减轻TGFβ-Smad2/3信号的过度激活。薯蓣皂苷元还调节损伤白质中的小胶质细胞活化，为移植的hOPC及内源性少突胶质细胞群体的成熟和整合创造有利的细胞环境。总之，这些发现揭示了一个新的、依赖MMP-9的机制，通过该机制薯蓣皂苷元提高了hOPC移植的治疗效果，强调了其作为辅助治疗策略促进白质损伤修复的潜力。