综述：网格蛋白非依赖性内吞途径的功能特化：机制与细胞角色

《Traffic》：Functional Specialization of Clathrin-Independent Endocytic Routes: Mechanisms and Cellular Roles

　　

网格蛋白非依赖性内吞（CIE）包括与网格蛋白介导的内吞平行运作的多种内化机制。尽管这些机制共享某些特征，但它们受不同的分子原理和调控逻辑支配。在本综述中，研究人员概述了CIE机制，特别关注各途径的功能特化。研究人员追溯了CIE概念的历史出现，并强调了细菌毒素和病毒如何作为关键发现工具，揭示了脂质驱动和凝集素介导的膜弯曲与内化机制。此外，研究人员描述了主要CIE机制的分子框架，并讨论了对其进行剖析的实验策略。研究人员强调了特定内吞途径的选择如何决定货物命运，引导受体和粘附分子走向回收、逆行运输或降解，以调节信号幅度、极性、迁移和上皮屏障功能。最后，研究人员提供了关于“无包被”CIE样机制的进化视角。

论文主体部分总结如下：

**1 Introduction**

内吞作用是一个基本的细胞过程，调控生理、发育和疾病的许多方面。除了营养摄取和膜稳态的经典作用，内吞作用现被认为是信号、细胞极性、迁移和组织稳态的主要组织者。网格蛋白介导的内吞（CME）是研究最深入的内吞途径，具有特征性的形态和分子特征，包括货物选择、膜弯曲、囊泡切割和脱包被。CME既可组成性运作，也可在配体诱导下发生。网格蛋白非依赖性内吞（CIE）途径的发现和表征扩展了基于CME的内吞概念框架。CIE包含一组异质性的摄取机制，缺乏CME的典型形态学标志，并在细胞类型和生理背景下表现出显著差异。本综述对CIE进行综合整合，优先考虑其不同机制的功能特化，首先考察CIE概念的历史出现，然后讨论细菌毒素和病毒作为发现工具的作用，总结CIE机制的研究现状，分析整合的遗传和化学方法如何阐明这些过程，进一步考察通过CIE内化的货物谱系，讨论这些内化机制在生理和癌症中的功能意义，最后提供进化视角。

**1.1 A Brief History of CIE**

细胞主动内化周围物质的概念源于Ilya Metschnikoff在1883年对吞噬作用的定义。随后，Warren H. Lewis在1931年将胞饮作用定义为“细胞饮水”。1953年，George E. Palade描述了质膜（PM）上的小囊泡，称为质膜小泡，后被Yamada命名为小窝。1975年，Barbara Pearse纯化了网格蛋白包被囊泡，建立了CME在膜运输中的主导范式。早期CIE的证据出现在1978年，观察到辣根过氧化物酶（HRP）通过光滑的环状囊泡内化，即后来的CLIC/GEEC载体。1985年，研究表明蓖麻毒素在CME抑制下仍能高效内化，确认了替代途径的存在。1990年代至2000年代初，Fast Endophilin-Mediated Endocytosis（FEME）和EGFR-Non-Clathrin Endocytosis（EGFR-NCE）等特定CIE机制被鉴定。近年来，高分辨率成像技术推动了CIE在分子和功能水平上的多维理解。

**1.2 Toxins and Viruses as Discovery Tools for CIE**

对细菌毒素和病毒的研究揭示了CIE机制。霍乱毒素（CTx）、志贺毒素（STx）、蓖麻毒素和多瘤病毒（SV40）等病原体在CME抑制时仍能内化，表明存在替代途径。毒素研究证明脂质结合病原体可以独立于网格蛋白和小窝驱动摄取，依赖于肌动蛋白-微管细胞骨架。对CTx和STx的研究确立了糖鞘脂和多价脂质结合在膜弯曲中的核心作用，促成了糖脂-凝集素（GL-Lect）假说的提出。该假说认为凝集素通过多价结合糖鞘脂，驱动膜弯曲和内化。病毒方面，SV40通过小窝/脂筏依赖的CIE进入细胞，而水疱性口炎病毒（VSV）用于监测CME。通过系统RNAi筛选，确定了路径特异性信号“特征”。后续研究利用病毒进入揭示了CLIC/GEEC介导HIV-1病毒样颗粒的摄取，并利用假型VSV颗粒研究埃博拉病毒和SARS-CoV-2的进入机制。

**1.3 Mechanisms of Clathrin-Independent Endocytosis**

CIE机制共享无网格蛋白依赖、刺激依赖性调控和与肌动蛋白动力学偶联的特征，但依赖不同的分子模块实现货物选择性、膜重塑和情境特异性运输结果。

**1.3.1 Clathrin-Independent Carriers/GPI-Enriched Endosomal Compartments (CLIC/GEEC)**

CLIC/GEEC是一种组成性激活的机制，内化GPI锚定蛋白、糖鞘脂和某些糖蛋白。摄取通过管状PM内陷，即CLICs，成熟为GEECs。核心调控因子包括BAR结构域蛋白（IRSp53、内啡素、CIP4）、小GTP酶（CDC42、ARF1及其GEF GBF1）、GRAF1和肌动蛋白成核因子ARP2/3。膜切割主要通过不依赖dynamin的机制，需要肌动蛋白聚合和动力蛋白介导的运输。Swip1被鉴定为连接活性β1整合素与CLIC机制的货物特异性接合蛋白。CLICs将货物递送至RAB5阴性的GEECs，随后成熟为RAB5阳性分选内体，货物可被导向溶酶体降解、回收至PM或通过逆行途径运输至反式高尔基体网络。

**1.3.2 Glycolipid-Lectin (GL-Lect) Driven Endocytosis**

GL-Lect驱动内吞内化多种货物，包括整合素、毒素、CD44和CD166。该机制偶联半乳凝素结合和糖基化货物的寡聚化与PM上糖鞘脂的聚集，导致膜弯曲和管状内陷。GL-Lect内吞最初针对半乳凝素-3定义，但也涉及其他半乳凝素（如半乳凝素-8）。细胞外半乳凝素-3单体被招募至PM后寡聚化为四聚体，多价结合糖基化货物和糖鞘脂，驱动纳米域组装和膜弯曲。货物上N-聚糖的空间重构对于有效招募半乳凝素-3至关重要，称为“构象糖开关”。生长因子可通过“去唾液酸化糖开关”机制调控GL-Lect内吞。细菌毒素（STx、CTx）通过其B亚基劫持该机制。切割通常通过肌动蛋白驱动、不依赖dynamin的机制实现。释放后的CLICs经历逆行运输至高尔基体，然后以极化方式回收至特定PM区域，支持细胞极性、定向迁移和局部信号。

**1.3.3 Fast Endophilin-Mediated Endocytosis (FEME)**

FEME是一种快速、dynamin依赖的CIE机制，负责G蛋白偶联受体（GPCR）、受体酪氨酸激酶（RTK）和IL-2R的配体诱导内化。配体刺激激活受体和CDC42信号，招募F-BAR蛋白（FBP17、CIP4）形成小膜斑块，作为内啡素A2的支架。内啡素A2寡聚化通过其N-BAR结构域放大膜弯曲，驱动快速形成管状囊泡载体。载体的切割由dynamin、内啡素A2和肌动蛋白通过摩擦驱动机制协调完成。FEME载体通过动力蛋白沿微管运输，最终与早期内体融合，再运输至晚期内体和溶酶体。

**1.3.4 EGFR–Non-Clathrin Endocytosis (EGFR-NCE)**

EGFR-NCE在上皮细胞中被高浓度EGF激活，通过类似CLIC/GEEC和GL-Lect内吞的管状PM内陷快速内化。该途径依赖PM、内质网（ER）和线粒体之间的三方接触位点，需要ER驻留蛋白网蛋白-3（RTN3）。这些平台通过局部ER Ca²⁺释放和增强的线粒体ATP产生协调膜重塑和dynamin依赖的切割。EGFR-NCE还需要CBL介导的受体泛素化，招募泛素结合接合蛋白（EPS15、EPS15L1、EPN1），将EGFR导向溶酶体降解。该途径作为强烈刺激下受体下调的关键机制。

**1.3.5 Flotillin-Mediated Endocytosis**

Flotillin 1和flotillin 2是SPFH超家族成员，在PM胞质面组装成异寡聚支架，位于鞘脂富集、不依赖小窝的微域中。这些微域作为货物聚集和信号平台。Flotillin介导的内吞产生小、无包被的flotillin阳性囊泡，融合至早期内体。该途径受Fyn激酶调控，内化多种货物，包括RTK、粘附分子和神经递质转运蛋白。内化后货物可被回收至PM或导向溶酶体。Flotillin支架还与病理运输程序相关，如“上调flotillin诱导的运输”（UFIT）。

**1.3.6 Additional Clathrin-Independent Mechanisms**

**1.3.7 ADBE (Activity-Dependent Bulk Endocytosis)**

ADBE是一种快速、高容量、活性依赖的CIE机制，在神经元突触运作，由细胞内Ca²⁺水平升高触发。其启动需要Ca²⁺依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶，协调内吞组分的去磷酸化。受Cdk5和GSK3β调控，以及F-BAR蛋白syndapin-I参与。与dynamin-1和肌动蛋白聚合共同促进膜切割，形成大于500 nm的大胞饮样内体。ADBE在剧烈神经元活动期间回收突触膜和相关蛋白，支持持续神经传递和突触前膜稳态。

**1.3.8 MEND (Massive Endocytosis)**

MEND由急性细胞应激触发，包括细胞内Ca²⁺超载、PKCθ/δ信号过度激活和PI3Kγ活性瞬时增加。该过程不依赖网格蛋白、dynamin和肌动蛋白，在肌动蛋白耗尽的PM区域优先发生。分子层面，DHHC5（ZDHHC5）及其底物酰基辅酶A诱导蛋白棕榈酰化循环，锚定蛋白于PM，促进内吞启动。胆固醇和PIP2可独立地促进Ca²⁺升高后几分钟内MEND的快速诱导。该途径的功能是快速消散潜在病理微簇，恢复膜平衡，内化有序PM域。

**1.3.9 UFE (Ultrafast Endocytosis)**

UFE发生在突触前活性区，在刺激后100毫秒内回收约60-80 nm的突触囊泡。胞吐膜添加导致的膜张力降低启动该途径，随后Ca²⁺内流诱导内啡素、突触素、dynamin和epsin的招募，并刺激局部肌动蛋白聚合驱动快速弯曲和出芽。内啡素和突触素促进快速凹陷成熟，epsin有助于膜弯曲生成，dynamin驱动膜分裂，肌动蛋白提供机械力。

**1.3.10 Macropinocytosis**

巨胞饮通过大规模膜皱褶介导受体非依赖性的胞外液体和PM的大量摄取。通常由RAS/PI3K依赖信号通路刺激，促进PM肌动蛋白重塑。巨胞饮支持营养清除和病原体监视，具有高内吞通量。形成的巨胞饮体为0.2-5 μm的明亮液泡，依赖于Na⁺/H⁺交换蛋白（NHE1）活性。巨噬细胞和未成熟树突状细胞显示组成性膜皱褶，而成纤维细胞和上皮细胞在稳态下活性低，但在生长因子刺激下快速诱导。在癌症等病理条件下，巨胞饮显著上调，通过清除外源氨基酸、脂质和蛋白质支持代谢重编程。尽管在机制上与“管状”CIE机制不同，但巨胞饮共享肌动蛋白依赖和网格蛋白非依赖性特征。

**1.4 Experimental Approaches to Study CIE: Integration of Genetic and Chemical Inhibitors**

内吞机制的实验解剖因分子机制重叠和补偿性激活而复杂化。常用抑制剂包括Dynasore及其衍生物，作为dynamin非竞争性抑制剂，但存在脱靶效应，如影响肌动蛋白聚合。Pitstop 2旨在抑制CME，但特异性受质疑。一些抑制剂设计用于破坏蛋白质-蛋白质相互作用，如D44-和D14-Dyn2多肽。化学抑制剂的广泛交叉反应性需要互补方法验证，包括使用途径富集标志物、siRNA或CRISPR-Cas9遗传扰动，以及表达显性负性构建体。遗传耗竭策略需注意长期耗竭可能触发补偿适应。常见抑制剂如Bolinaquinone、Pitstop 1-2、Dynasore、Latrunculin、Filipin、MβCD、LG186、ML141、CK666、Ciliobrevin D、I3、Lactose、EIPA等，各有其靶点、机制、剂量、特异性和毒性，需结合成像、遗传消融和货物追踪实验综合判断。

**1.5 Cargoes and Biological Functions of CIE**

CME和CIE通常内化重叠的货物集合，但内吞途径选择强烈影响货物命运。EGFR内吞为例：低浓度EGF时通过CME主要促进回收，高浓度时激活EGFR-NCE优先导向溶酶体降解，从而限制过度RTK信号，同时通过PM-ER-线粒体接触位点局部产生ATP支持迁移。FEME在迁移细胞前缘强烈激活，促进生长因子受体内化和信号转导，支持细胞运动和侵袭。CLIC/GEEC和GL-Lect机制通过控制糖蛋白和GPI锚定蛋白的极化分布调控粘附分子运输。CLIC/GEEC促进活性β1整合素从基底面内吞并回收至前缘，支持定向迁移。非活性β1整合素通过GL-Lect从顶面内吞。GL-Lect内吞受生长因子信号通过去唾液酸化糖开关调控，增强半乳凝素结合，促进整合素等货物运输至迁移细胞前缘。在肠道上皮中，GL-Lect内吞介导乳转铁蛋白（LTF）的跨细胞转运，支持上皮屏障功能。此外，内啡素A3/半乳凝素-8依赖机制控制癌症相关粘附分子CD166的内化，并影响肿瘤细胞粘附和迁移，以及免疫突触形成，暗示CIE在肿瘤-免疫相互作用中的作用。

**1.6 Outlook: Lessons From the Past**

CME与CIE的功能分化反映了效率与适应性的权衡。CIE的多样化和进化可能揭示了早期细胞组织与动态特征。内吞作用与内膜系统是真核生物发生的关键阈值，线粒体通过“ATP-每-基因”优势支持这一转变。真核生物共同祖先（LECA）可能已具有广泛的运输库。内共生是真核生物起源的核心，系统发育证据将真核生物置于Asgard古菌超门内。Asgard基因组编码许多真核特征蛋白，包括细胞骨架组分、膜重塑系统和涉及运输的小GTP酶。最新研究显示，Heimdallarchaeon候选菌Yibarchaeum umbracryptum可能具有原始内吞样活性，缺乏经典真核运输同源物，但编码与真核flotillin同源的SPFH家族蛋白，支持早期内吞过程依赖CIE样机制的模型。大规模系统基因组分析支持Asgard古菌对真核功能系统的主要贡献，而α-变形菌贡献限于能量代谢。替代模型提出“三或更多伙伴”参与，包括细菌宿主、Asgard古菌和线粒体二次内共生，以解释脂质兼容性问题。Planctomycetota可能贡献了脂质代谢基因和类似吞噬的特征。总体而言，真核生物发生仍是一个不断发展的范式，系统基因组数据和定量模型正推动领域从概念框架转向经验重建。

**2 Concluding Remarks**

CIE的功能意义超越货物内化本身。不同CIE途径选择性地将货物导向不同的细胞内目的地，包括回收、逆行运输、转胞吞或降解，从而影响信号、极性、迁移和上皮屏障功能。摄取机制与货物命运的耦合是CIE功能特化的核心原理。从进化视角看，CIE途径的多样化可能反映了祖先膜重塑工具箱对真核细胞日益复杂的运输和信号需求的逐步适应。