《Cells》：Opioid Exposure Induces the Expression of the Purinergic Receptor P2RY11 in Human Nociceptors
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背根神经节（DRG）的原代感觉神经元表达μ型阿片受体，并经历可塑性变化，这可能有助于镇痛，也可能导致阿片耐受和阿片诱导的痛觉过敏（OIH）等适应不良后果。大多数机制研究依赖于啮齿动物模型，但这类模型可能无法完全捕捉人类中存在的阿片类反应通路谱。在这项研究中，研
背根神经节（DRG）的原代感觉神经元表达μ型阿片受体，并经历可塑性变化，这可能有助于镇痛，也可能导致阿片耐受和阿片诱导的痛觉过敏（OIH）等适应不良后果。大多数机制研究依赖于啮齿动物模型，但这类模型可能无法完全捕捉人类中存在的阿片类反应通路谱。在这项研究中，研究人员测试了吗啡暴露是否重塑人类伤害感受器中的基因表达程序。研究人员将人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的伤害感受器暴露于吗啡（3.5 μM），进行急性（1小时、16小时）或重复（2–3天；每日16小时暴露，间隔8小时洗脱）处理，并通过时间序列RNA测序进行谱系分析。吗啡的转录反应包括在多种暴露模式下诱导一小部分基因。编码嘌呤能G蛋白偶联受体P2Y11的P2RY11是整个时间过程中最显著诱导的转录本，而参与嘌呤能信号通路的基因表现出协调的表达动态。由于P2RY11缺乏小鼠/大鼠直系同源物，其对伤害感受器生物学和阿片类反应的贡献在很大程度上仍未得到充分探索。利用来自器官捐献者的人类DRG组织和原代人类DRG培养物，研究人员在神经元群体中检测到P2RY11 mRNA和P2Y11蛋白。研究人员观察到，在体外吗啡暴露后，外周蛋白（peripherin）阳性神经元中P2Y11表达增加，这证实了测序结果。这些发现将P2RY11/P2Y11鉴定为DRG神经元中一种吗啡响应的嘌呤能受体，并提名嘌呤能信号作为促成阿片类药物驱动的外周可塑性的候选通路。
**研究背景、问题及研究意义**
阿片类镇痛药是治疗中重度疼痛最有效的药物之一，但其长期使用受到阿片耐受和阿片诱导的痛觉过敏（OIH）等不良后果的限制。阿片耐受反映的是镇痛效果的逐渐丧失，而OIH则是阿片类药物暴露期间出现的疼痛敏感性矛盾性增加。这些适应性变化使疼痛管理复杂化，并促使研究人员寻找能够将持续镇痛与适应不良可塑性分离开来的分子机制和靶点。背根神经节（DRG）的原代感觉神经元表达μ型阿片受体（MOR-1），是阿片类药物的直接靶点。除了介导外周阿片类镇痛，DRG神经元还会经历阿片类驱动的可塑性，从而改变其兴奋性、细胞内信号传导以及对炎症介质的反应性。然而，大多数对这些过程的机制性见解来自于啮齿动物模型。比较转录组学研究表明，人类和啮齿动物DRG之间存在显著差异，尤其是在G蛋白偶联受体（GPCR）和其他可药物化的信号蛋白方面。这些差异提出了一个可能性，即阿片类药物可能激活与人类疼痛相关的、但并非必然在非人类临床前模型中存在的通路。这促使研究人员使用人类体外平台，包括人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的伤害感受器和来自器官捐献者的原代人类DRG（hDRG）神经元。这些系统在人类遗传背景下，能够重现人类DRG神经元的关键分子和功能特征，并实现可控的阿片类药物暴露实验。
本研究旨在利用人类模型定义吗啡如何重塑急性和重复暴露下的基因表达程序。研究人员发现，编码嘌呤能G蛋白偶联受体P2Y11的P2RY11基因，是hiPSC衍生伤害感受器中吗啡暴露后最显著且持久的诱导转录本。由于P2RY11在小鼠和大鼠中缺乏直系同源物，其对伤害感受器生物学和阿片类反应的贡献在很大程度上尚不明确。该研究通过在人DRG组织中验证P2Y11的表达，并证实吗啡可诱导其表达增加，从而将P2RY11/P2Y11鉴定为DRG神经元中一种阿片类响应的嘌呤能受体，并提名嘌呤能信号作为可能促成阿片类驱动的外周可塑性的候选通路。该论文发表在《Cells》。
**关键技术与方法**
研究人员主要采用了以下关键技术方法：1. **时间序列RNA测序**：对hiPSC衍生的伤害感受器进行吗啡暴露（3.5 μM），在基线（0小时）、急性单次暴露（1小时、16小时）和重复暴露（2天、3天；每日16小时暴露，间隔8小时洗脱）后收集样本，进行RNA提取和测序，以识别吗啡响应的转录本。2. **差异表达和聚类分析**：使用ImpulseDE2进行时间序列差异表达分析，并使用TCSeq进行基于模糊c均值的聚类分析，以识别共表达动态模式并进行功能富集。3. **免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）**：在来自器官捐献者的人类DRG组织切片和原代培养的hDRG神经元中，使用特定抗体检测P2Y11、外周蛋白（peripherin）和TRPV1的蛋白表达和共定位。4. **线性混合效应模型分析**：对原代hDRG神经元中P2Y11免疫反应性的定量荧光强度数据进行统计分析，以确定吗啡暴露时间的影响。5. **人类DRG单核转录组学分析**：利用已发表的协调跨物种DRG参考图谱，分析P2RY11在人类DRG神经元亚型中的表达分布。样本队列来源为经伦理同意的器官捐献者。
**研究结果**
**3.1 时间序列RNA测序识别吗啡调控的转录本**
通过对hiPSC衍生伤害感受器进行吗啡时间梯度暴露并进行RNA测序，研究人员发现相对于基线，在每个时间点（1小时、16小时、2天、3天）均有一小组差异表达基因（DEGs）。共有19个DEGs（p-adj ≤ 0.05, |log2FC| ≥ 0.6），其中8个上调，11个下调。值得注意的是，P2RY11在所有时间点均持续上调，是表现最显著的DEG。基因本体论（GO）基因集富集分析（GSEA）显示，不同时间点的转录谱富集了与生长因子反应、结构包裹、发育和细胞迁移等相关的生物学过程。
**3.2 时间序列差异表达和聚类将P2RY11诱导及相关基因动态与阿片类暴露联系起来**
通过时间序列差异表达分析（ImpulseDE2）鉴定出36个动态DEGs（dDEGs）。将这些动态表达的基因进行模糊c均值聚类，得到6个具有不同时间轨迹的簇。P2RY11位于簇1，该簇以表达持续增加为特征，并富集了与细胞-细胞连接组织和离子流（包括阳离子和钙跨膜转运）相关的基因。P2RY11是时间序列中最显著的dDEG。其他簇分别代表了早期响应基因、早期下调基因等，其中富集了与ATP合成、GPCR信号、钙离子内流、细胞因子信号等相关的生物学过程。这些分析共同将P2RY11和P2Y11介导的信号传导确定为人类伤害感受器阿片类反应中的一个候选通路。
**3.3 P2RY11/P2Y11在hDRG神经元中表达并随吗啡暴露增加**
通过分析协调的人类DRG单核数据集，发现P2RY11在大多数hDRG神经元亚型中均有表达，而非仅限于单一类别。在人DRG组织的免疫染色中，检测到P2Y11与外周蛋白（peripherin）和TRPV1阳性伤害感受器共定位。在来自三位独立器官捐献者的原代培养hDRG神经元中，基线时即可在外周蛋白阳性神经元中检测到P2Y11免疫反应性。与转录组学结果一致，半定量分析显示，与基线相比，在1小时（FC 1.46, p = 0.0036）、2天（FC 1.53, p = 0.0046）和3天（FC 1.55, p = 0.0108）的吗啡暴露后，P2Y11免疫反应强度显著增加，而16小时（FC 1.15, p = 0.5823）的增加不显著。
**讨论与结论**
讨论部分总结了本研究的主要发现，即通过hiPSC衍生伤害感受器鉴定出P2RY11是强效的吗啡诱导转录本，并在人类DRG组织和原代培养物中验证了P2Y11的表达及其受吗啡诱导的上调。研究人员将P2RY11/P2Y11定位为人类伤害感受器中的阿片类响应嘌呤能受体。研究认为，这些发现构成了一个基础，用于定义P2Y11信号在阿片类驱动的外周可塑性中的潜在贡献，但指出所观察到的变化是早期转录事件，可能与长期可塑性的前兆有关，而非已建立的耐受或OIH的关联物。讨论还强调，由于P2RY11缺乏小鼠/大鼠直系同源物，这类人类特异性通路在常规啮齿动物模型中无法被研究，凸显了人类模型的重要性。研究同时指出了局限性，包括未建立功能因果关系、转录组发现样本量有限、重复暴露范式中洗脱期可能引入依赖戒断效应，以及人类验证仅基于单一hiPSC细胞系和有限数量的器官捐献者样本。最后，讨论提出了未来的研究方向，包括区分持续MOR-1激活与戒断适应、通过CRISPR干扰或反义寡核苷酸进行功能测试，以及扩展到其他阿片类药物等。
**研究结论部分翻译**：总的来说，研究人员对hiPSC衍生的人类伤害感受器进行的时间序列转录组分析，将P2RY11鉴定为一个强效的吗啡诱导基因。结合人类DRG转录组学、蛋白定位和原代DRG培养验证，这确立了P2Y11作为人类感觉神经元中阿片类响应信号的一个先前未被充分认识的组成部分。这些结果扩展了人类相关的阿片类响应靶点集，并强调了基于人类模型在揭示疼痛机制方面的重要性。
