《Foods》：A Bioengineered Glycosyl Hydrolase Effectively Disrupts Campylobacter jejuni Biofilms
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生物膜显著促进了空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的持久性和传播，然而针对这些结构的酶解策略仍未得到充分探索。在本研究中，研究人员评估了一种糖基水解酶（glycosyl hydrolase）CAase对浮游态和生物膜相关C. jejuni的
生物膜显著促进了空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）的持久性和传播，然而针对这些结构的酶解策略仍未得到充分探索。在本研究中，研究人员评估了一种糖基水解酶（glycosyl hydrolase）CAase对浮游态和生物膜相关C. jejuni的活性。CAase在浓度高达1 mg/mL时对浮游生长无抑制效应。然而，在0.1 mg/mL浓度下，CAase使野生型菌株的成熟生物膜生物量减少超过93%，并在luxS突变株中产生类似程度的减少，这表明胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）中保守的聚糖组分被显著降解。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）成像显示，经CAase处理后，细胞外基质大量丢失、结构破坏以及细胞形态改变。流变学测量表明运动黏度显著降低，进一步反映了生物膜内聚力减弱。综上，这些结果表明，尽管缺乏直接抗菌活性，CAase仍能有效破坏C. jejuni生物膜结构的多个组分。这种程度的生物膜去除提示其在禽类加工或表面消毒应用中具有潜在用途，其中靶向酶解可增强清洁效果。
**研究背景、问题与目的**
空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球细菌性胃肠炎的主要病原体，对食品安全构成重大挑战，尤其在禽类生产与加工环境中。该菌能在低氧微需氧条件下存活，并定殖于不锈钢、塑料等工业材料表面形成生物膜，从而抵抗干燥、温度波动及常规消毒处理。生物膜的保护作用源于其胞外聚合物（extracellular polymeric substance, EPS）基质，该基质在C. jejuni中富含蛋白质，赋予其较高的机械稳定性与较低的渗透性，使得针对碳水化合物的消毒剂效果受限。尽管如此，C. jejuni的EPS仍含有关键的聚糖组分（如荚膜多糖、糖蛋白、脂寡糖相关碳水化合物），这些成分维系基质内聚力，可能成为酶解靶点。糖基水解酶（glycosyl hydrolases, GHs）通过特异性切割EPS中的糖苷键，已被证明能有效破坏多种食源性病原菌的生物膜。CAase是一种生物工程改造的GH，其对大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7、鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhimurium）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的成熟生物膜具有去除作用，但尚未在C. jejuni中进行评估。考虑到C. jejuni EPS蛋白质含量高但含有聚糖，研究人员旨在探究CAase能否有效破坏其生物膜，并评估其在不同EPS组成（野生型与luxS突变株）中的活性差异。本研究通过评估CAase对浮游生长和成熟生物膜的影响，并利用生物量定量、扫描电子显微镜（SEM）和流变学表征结构和力学变化，为聚糖裂解酶控制持久性C. jejuni生物膜的可行性及应用潜力提供关键见解。论文发表在《Foods》。
**主要关键技术与方法**
研究人员采用以下关键技术方法：
1. 最小抑菌浓度（MIC）测定：通过微量肉汤稀释法评估CAase对C. jejuni 81-176浮游生长的抑制效果。
2. 生物膜培养与处理：在三种不同底物类型和表面积条件下（14 mL聚丙烯管、10 cm2平底培养管、40 μm尼龙细胞滤网）培养5天形成成熟生物膜，随后用0.1 mg/mL CAase在微需氧条件（42°C）下处理2小时。
3. 生物膜定量：采用结晶紫（crystal violet, CV）染色法，在590 nm处测量吸光度（OD???）以评估残留生物量。
4. 扫描电子显微镜（SEM）观察：对处理前后的生物膜进行固定、脱水、临界点干燥及镀金，使用Quanta 200 FEG扫描电镜观察细胞形态和基质结构。
5. 运动黏度测量：使用校准玻璃毛细管黏度计（0.1 cSt/s）测量生物膜样本的流动时间，计算运动黏度（ν = t × C）。
样本来源：C. jejuni 81-176野生型菌株及其luxS缺失突变株（由实验室构建）。
**研究结果**
**3.1 CAase对C. jejuni生长的影响**
通过MIC测定，CAase在0.001953125–1.0 mg/mL浓度范围内均未抑制C. jejuni 81-176的生长，48小时微需氧培养后OD???值与未处理对照无显著差异（Tukey–Kramer检验，α=0.05），仅热灭活对照无生长。表明CAase缺乏直接抗菌活性，其生物学效应源自非生长抑制机制。
**3.2 CAase介导的C. jejuni生物膜破坏**
CAase处理（0.1 mg/mL，2小时）显著减少两种菌株（野生型与luxS突变株）在所有培养设置下的生物膜生物量。结晶紫定量显示，野生型生物膜生物量减少超过93%，luxS突变株减少超过91%（图3）。目视观察可见处理后的生物膜被破坏并从滤网释放，流穿液浑浊度增加。表明CAase能有效降解不同EPS背景的C. jejuni成熟生物膜。
**3.3 SEM观察C. jejuni生物膜**
SEM图像显示，未经处理的成熟生物膜具有丰富的EPS和三维结构，螺旋状细胞嵌入致密基质中。CAase处理后，细胞外基质物质明显减少，表面结构破坏，细胞形态改变，表明基质完整性受损，生物膜稳定性下降。
**3.4 CAase对C. jejuni生物膜运动黏度的影响**
流变学测量显示，CAase处理显著改变了野生型和luxS突变株生物膜的流动行为。野生型流动时间从16.5秒降至9.1秒（黏度从1.65 cSt降至0.91 cSt），luxS突变株从14.3秒降至8.3秒（1.43 cSt降至0.83 cSt）（p<0.05，单因素方差分析）。处理后的样本更均匀，凝胶状物质减少，表明生物膜内聚力减弱，结构更易被剪切力分散。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CAase处理导致C. jejuni生物膜结构严重降解，SEM证实基质减少、表面结构破坏及细胞形态改变，与结晶紫生物量减少一致。CFU计数确认CAase不影响细胞活力，说明其作用为结构破坏而非杀菌。黏度测量间接支持CAase削弱生物膜力学完整性，但可能源于EPS降解、生物量减少、聚集改变及三维结构破坏等多因素，不能直接证明聚糖水解。CAase对浮游生长无抑制，表明其靶向胞外基质而非细胞代谢。在野生型与luxS突变株中效果一致，提示CAase可能作用于对生物膜稳定性重要的聚糖成分，但这一机制仍需直接证据。CAase的效果与其他GH（如DNase I、纤维素酶、α-淀粉酶）类似，具有作为酶基生物膜控制策略的潜力。
研究结论（翻译自原文结论部分）：本研究证明，尽管CAase不抑制C. jejuni的浮游生长，但它通过降解关键胞外基质组分对已形成的生物膜发挥强烈的破坏作用。CAase处理显著减少了生物膜生物量，削弱了结构内聚力，改变了流变学性质，并产生了SEM可观察到的显著结构损伤。其对野生型和luxS突变株的一致活性表明，CAase可能作用于对生物膜稳定性重要的聚糖元件，但这仍是一个假设而非本研究中直接证明的机制。总之，这些发现支持CAase作为破坏持久性C. jejuni生物膜的有前景的抗生物膜候选物。需要进一步的机制和应用研究来确定其全部效用，并评估其在更广泛的环境和工业条件下的有效性。
