《Foods》：Changes in Quality Characteristics, Microbial Communities, and Metabolomic Profiles of Mianning Ham During Different Aging Periods
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冕宁火腿是中国西南地区的一种传统干腌火腿（dry-cured ham），但研究人员对长期成熟过程中品质变化、微生物演替（microbial succession）和非挥发性代谢物重塑（nonvolatile metabolite remodeling）之间的协
冕宁火腿是中国西南地区的一种传统干腌火腿（dry-cured ham），但研究人员对长期成熟过程中品质变化、微生物演替（microbial succession）和非挥发性代谢物重塑（nonvolatile metabolite remodeling）之间的协调关系仍知之甚少。因此，研究人员对陈化一、二、三和四年的冕宁火腿样本进行了比较分析。采用高通量测序（high-throughput sequencing）表征微生物群落组成，并应用非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）分析差异代谢物变化及其与优势微生物的关联。结果表明，冕宁火腿的理化和感官特性在成熟过程中呈现阶段依赖性变化，水分含量和pH值总体下降，而颜色、质地和成熟风味特征逐渐形成。多变量统计分析鉴定出99种差异代谢物，主要涉及肽积累、氨基酸代谢和含氮化合物转化。细菌群落主要由厚壁菌门（Bacillota）和变形菌门（Pseudomonadota）组成，而子囊菌门（Ascomycota）是优势真菌门。在不同成熟阶段观察到优势微生物类群的明显演替模式。此外，微生物-代谢物相关性分析揭示了火腿内部和表面样本之间存在不同的关联模式。内部微生物群落主要与核苷酸相关代谢和鲜味相关特征有关，而表面微生物群落与蛋白质来源的含氮化合物转化和风味前体积累更为密切。本研究揭示了冕宁火腿成熟过程中品质形成规律，为成熟阶段评价和品质调控提供了理论基础。
**研究背景、问题与目的**
冕宁火腿（Mianning ham）是四川省凉山彝族自治州的传统干腌火腿（dry-cured ham），拥有超过500年的生产历史，已被认定为中国国家地理标志农产品。其品质受原料、加工工艺、环境条件和成熟时间等多种因素共同影响，其中成熟时间尤为关键，因为理化性质、微生物群落和代谢物谱在成熟过程中持续变化。然而，现有研究多聚焦于金华、宣威、诺邓等火腿的微生物或挥发性风味特征，对冕宁火腿长期成熟（1～4年）过程中品质变化、微生物演替与非挥发性代谢物重塑之间的协同关系尚缺乏系统认识。为此，研究人员整合品质测定、高通量测序（high-throughput sequencing）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics），对1年、2年、3年和4年成熟期的冕宁火腿样本进行多维度分析，旨在揭示品质形成规律，为成熟阶段评价和品质调控提供理论依据。该论文发表在《Foods》期刊。
**关键技术方法**
样本来源：四川省凉山彝族自治州余记火腿食品有限公司，分别于2021、2022、2023、2024年10月开始加工，2025年10月同时采集对应4年、3年、2年、1年成熟期火腿，每阶段3个独立火腿，共12个样本。主要方法：1）理化测定：水分含量（105℃烘干法）、pH（pH计）、硫代巴比妥酸反应物（TBARS，mg MDA/kg）、总挥发性盐基氮（TVB-N，mg/100 g）；颜色（色差计L*、a*、b*）、质地剖面分析（TPA：硬度、弹性、咀嚼性、内聚性、回复性）。2）感官评价：10位训练评委（20～30岁，5男5女）对色泽、香气、滋味、质地按0～7分制评分。3）微生物多样性：分别提取表面（无菌拭子）和内部肌肉总DNA，细菌16S rRNA基因（341F/805R）和真菌ITS1区（fITS7F/ITS4R）扩增，DNBSEQ-G99平台双端测序，QIIME 2（DADA2）获得ASV，SILVA数据库注释。4）非靶向代谢组学：LC-MS（Waters ACQUITY HSS T3柱，0.1%甲酸-水/乙腈流动相，正负离子模式），原始数据经峰检测、对齐、归一化，基于精确质量数和MS/MS碎片注释代谢物。5）统计：单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较，OPLS-DA筛选差异代谢物（VIP>1.5，p<0.05），KEGG富集分析，Spearman相关性（|r|≥0.6，p<0.05）。
**研究结果**
**3.1 理化性质分析**
通过水分、pH、TVB-N、TBARS测定，发现：水分含量随成熟时间延长持续下降（1年49.97 g/100 g，4年显著降低）；pH逐渐降低（1～2年约6.00，3年5.89，4年5.78），与乳酸菌（Latilactobacillus）相对丰度增加引起的有机酸积累一致；TVB-N逐年上升（3～4年显著增加，仍在正常范围），反映蛋白质降解和含氮化合物转化；TBARS先升后降（3年达峰值1.41 mg/kg，4年下降），可能与后期微生物代谢产生的抗氧化肽有关。
**3.2 感官分析**
颜色和质地测定及雷达图评价显示：L*值下降，a*和b*值升高（4年最高），表明火腿变暗且红度、黄度增强，与锌原卟啉等稳定红色素积累有关；硬度逐步增加（4年10818.68 gf），弹性、咀嚼性、回复性在3年达到最优，内聚性在2年最高；感官评分中，3～4年火腿在色泽、香气（陈肉香、脂肪香）、滋味和硬度上得分更高，与质构仪结果一致。
**3.3 小分子代谢物分析**
**3.3.1 多变量统计分析**
LC-MS在正负离子模式下共检出22,887和1,698种代谢物，以脂类和脂类分子、有机酸及衍生物、有机杂环化合物为主；OPLS-DA得分图显示不同成熟期样本明显分离（R2Y=0.999，Q2=0.863），模型可靠。
**3.3.2 特征代谢物鉴定**
以VIP>1.5和p<0.05筛选出99种差异代谢物，热图呈现阶段特异性分布。第一类为持续积累代谢物（如Glyc-Pro、Glu-Gly、Arg-Ile、L-高精氨酸、肌肽、瓜氨酸等），在3～4年丰度升高；第二类为早期富集代谢物（如肌酸、顺,顺-粘康酸、缬氨酰半胱氨酸），在1年丰度高后逐渐下降。此外，芳香族和杂环代谢物（如迷迭香酸、N-乙酰血清素、4-乙基苯酚、对氨基苯甲酸）在4年样本中丰度较高。
**3.3.3 KEGG富集分析**
14条潜在关键代谢通路中，差异代谢物主要富集于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，β-丙氨酸代谢，精氨酸生物合成，组氨酸代谢等氨基酸代谢通路，表明氨基酸代谢是成熟过程中代谢物重塑的主要方向，与蛋白质降解、肽积累及鲜味、甜味、苦味平衡密切相关。
**3.4 细菌群落结构分析**
**3.4.1 细菌多样性**
16S rRNA测序获得564,674条高质量序列；内部样本中，1年火腿ACE、Chao1、Shannon、Simpson指数最高，4年最低；表面样本中，4年ACE、Chao1最高，3年Shannon、Simpson最高；PCoA和PERMANOVA显示，成熟时间对表面细菌群落结构有显著影响（R2=0.4399，p=0.023），对内部影响接近显著（R2=0.3314，p=0.052）。
**3.4.2 细菌群落组成**
门水平：内部样本以厚壁菌门（Bacillota）和变形菌门（Pseudomonadota）为主，Bacillota相对丰度从1年67.30%降至4年41.15%，Pseudomonadota升至4年51.47%；表面样本同样以Bacillota和Pseudomonadota为主，Bacillota保持较高丰度。属水平：内部样本中葡萄球菌属（Staphylococcus）在各年份均较丰富，库什纳菌属（Kushneria）在4年升至23.84%，嗜胨菌属（Peptoniphilus）和厌氧球菌属（Anaerococcus）随成熟降低；表面样本中，Staphylococcus丰度随成熟下降（1年84.42%→4年29.50%），芽孢杆菌属（Bacillus）在4年升至41.57%，欧文氏菌科未分类属（Erwiniaceae_unclassified）在2年达44.56%后下降。
**3.5 真菌群落结构分析**
**3.5.1 真菌多样性**
ITS测序获得567,271条有效序列；内部样本中，2年ACE、Chao1最高，3年Shannon、Simpson最高；表面样本中，4年ACE、Chao1、Shannon、Simpson最高；PERMANOVA显示成熟时间对内部和表面真菌群落结构均有显著影响（内部R2=0.9729，p=0.001；表面R2=0.7208，p=0.015）。
**3.5.2 真菌群落组成**
门水平：子囊菌门（Ascomycota）在内部和表面样本中均占绝对优势（>95%），担子菌门（Basidiomycota）丰度较低。属水平：内部样本中，曲霉属（Aspergillus）在1～3年占主导（98.06%→79.32%），4年被酵母菌目未分类属（Saccharomycetales_unclassified）取代（91.78%）；表面样本中，Aspergillus在1～3年占主导（>97%），4年降至22.69%，Saccharomycetales_unclassified和干霉属（Xerochrysium）分别升至49.33%和24.76%。
**3.6 微生物与代谢物相关性分析**
选取17种代表性差异代谢物和20个优势属进行Spearman相关性分析。内部微生物与代谢物呈现三个聚类群：第一群（Aspergillus、Staphylococcus、Debaryomyces）与氨基酸和肽类代谢物（如N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、瓜氨酸）正相关，表明Aspergillus参与蛋白质降解和含氮化合物转化；第二群（Latilactobacillus、Yamadazyma）与D-果糖正相关，参与碳水化合物代谢；第三群（Xerochrysium、Sterigmatomyces、Kushneria、Phyllobacterium）与核苷酸代谢物（5′-鸟苷一磷酸、腺苷）正相关，Kushneria可能与鲜味核苷酸形成有关。表面微生物与代谢物呈现不同模式：第一群（Aspergillus、Staphylococcus、Debaryomyces）与多种氨基酸和肽类代谢物正相关，Staphylococcus可能通过硝酸还原酶和蛋白酶影响色泽和风味；第二群（Salimicrobium、Lactobacillus、Wallemia）与D-果糖正相关；第三群（Bacillus、Penicillium、Xerochrysium、Paraxerochrysium、Trichoderma）与肌肽、瓜氨酸、吡哆醛等含氮代谢物正相关，Bacillus在后期促进蛋白质降解产物转化和鲜味肽形成。整体上，内部微生物主要关联核苷酸代谢和鲜味特征，表面微生物更关联蛋白质来源含氮化合物转化和风味前体积累。
**总结与结论**
研究系统表征了冕宁火腿成熟过程中的品质变化，发现水分含量和pH下降，硬度、咀嚼性、颜色显著变化，感官风味明显增强。非靶向代谢组学表明成熟时间通过促进蛋白质降解、肽释放和氨基酸代谢重塑小分子代谢物谱，驱动早期底物消耗向后期风味前体富集转变。细菌群落以厚壁菌门和变形菌门为主，真菌以子囊菌门为主；内部优势菌属为葡萄球菌属和库什纳菌属，表面优势菌属为葡萄球菌属和芽孢杆菌属；真菌群落从曲霉属向酵母类群演替。微生物-代谢物相关性分析揭示了内部和表面样本的不同关联模式，内部微生物主要与核苷酸代谢和鲜味特征相关，表面微生物与含氮化合物转化和风味前体积累相关。这些发现突出了微生物演替和代谢重塑在冕宁火腿品质形成中的潜在作用。未来结合关键微生物的功能验证，可进一步阐明其与风味相关代谢物的互作机制。
