使用低共熔溶剂从葡萄皮中提取花青素的新方法

《Sustainable Chemistry》：New Approaches for the Extraction of Anthocyanins from Grape Skins Using Deep Eutectic Solvents

　　

研究人员选择了低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DES）作为从红葡萄皮中提取花青素的高效且环境友好的溶剂替代传统基于甲醇的混合物。采用计算机模拟研究（COSMO-RS）作为筛选工具，以确定最合适的选项，显著减少了待研究的潜在DES的化学空间。共评估了30,132种DES组合。选取的DES包含多元醇（乙二醇、甘油、1,2-丙二醇和1,6-己二醇）和羧酸（柠檬酸、草酸、苹果酸和乳酸）作为氢键供体（HBD），以及氯化胆碱、甜菜碱或盐类（碳酸钾、乙酸钠和丙酸钠）作为氢键受体（HBA）。选择氯化胆碱:甘油和氯化胆碱:草酸作为溶剂，优化超声辅助提取和微波辅助提取花青素的时间、温度和水含量。在两种情况下，约20 wt%的水被确定为最大化提取量的最佳条件，而提取时间和温度则取决于花青素的类型。通过微波辅助提取（氯化胆碱:草酸）获得的锦葵素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）的量为172 ± 7 mg/kg，通过超声辅助提取（氯化胆碱:甘油）获得的量为119.5 ± 0.5 mg/kg，与传统方法相比，性能分别提高了64%和13%。

### 论文解读：使用低共熔溶剂从葡萄皮中提取花青素的新方法

#### 研究背景与问题提出

葡萄是全球广泛种植的水果作物之一，年产量超过7000万吨，其中约50%用于酿酒。酿酒过程中产生的主要副产品是葡萄渣（占葡萄总重量的15–20%），全球每年产生多达700万吨葡萄渣。这些副产品（如葡萄皮、葡萄渣和葡萄叶）是酚类化合物的丰富来源，可作为功能性食品配料用于抗氧化膳食补充剂。红葡萄皮富含花青素（anthocyanins）和黄酮醇（flavonols）。传统上，从葡萄皮中提取花青素使用极性溶剂，如酸化甲醇-水或酸化乙醇-水。然而，甲醇具有毒性，乙醇虽毒性较低但提取效率有限。近年来，低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DES）作为绿色、可持续的替代溶剂受到关注。DES由氢键供体（Hydrogen Bond Donor, HBD）和氢键受体（Hydrogen Bond Acceptor, HBA）组成，可在低温下形成液态混合物。然而，DES种类繁多，传统实验筛选耗时费力，且部分DES（如基于乙二醇的）可能具有毒性或受法规限制（如氯化胆碱在化妆品中禁用）。因此，需要一种高效的方法来筛选最合适的DES，并优化提取条件以提高花青素提取效率，同时保证环境友好性和安全性。

#### 研究内容与结论

本研究旨在优化红葡萄皮中花青素的提取方法。研究人员将计算机模拟（in silico）与实验设计（Design of Experiments, DoE）相结合，以识别最佳的DES组成和提取条件。首先，通过COSMO-RS（真实溶剂导体屏蔽模型）筛选了30,132种DES组合，评估了两种模型花青素化合物（锦葵素-3-O-葡萄糖苷malvidin-3-O-glucoside, Mal-3G和锦葵素-3-O-(6-对香豆酰基)葡萄糖苷malvidin-3-O-(6-p-coumaroyl)glucoside, Mal-3G-cou）在无限稀释条件下的活度系数（activity coefficient at infinite dilution, γ^∞）。基于筛选结果，选择了15种DES进行实验验证，包括氯化胆碱、甜菜碱、乙酸钠、丙酸钠和碳酸钾作为HBA，以及甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,6-己二醇、柠檬酸、草酸、苹果酸和乳酸作为HBD。实验采用超声辅助提取（Ultrasound-Assisted Extraction, USAE）和微波辅助提取（Microwave-Assisted Extraction, MAE）两种技术，并优化了水含量、时间和温度等参数。结论表明，氯化胆碱:甘油（DES 4）和氯化胆碱:草酸（DES 5）是最有效的DES。对于微波辅助提取，最佳条件为45°C、27.5分钟和20 wt%水；对于超声辅助提取，最佳条件为60分钟和20 wt%水。与传统溶剂（甲醇/水/甲酸）相比，微波辅助提取（DES 5）使Mal-3G的提取量提高64%，超声辅助提取（DES 4）提高13%。该研究证明了DES作为绿色提取溶剂的潜力，为化妆品、制药和食品工业提供了更安全、更高效的替代方案。论文发表在《Sustainable Chemistry》。

#### 主要关键技术方法

本研究采用以下关键技术方法：1）**计算机模拟筛选（COSMO-RS）**：利用真实溶剂导体屏蔽模型计算花青素模型化合物在DES中的无限稀释活度系数（γ^∞），评估30,132种DES组合的溶解能力。2）**超声辅助提取（USAE）**：使用DES 4（氯化胆碱:甘油，1:1）在室温下进行提取，通过响应面法（Response Surface Methodology, RSM）优化水含量（20–80%）和时间（5–60分钟）。3）**微波辅助提取（MAE）**：使用DES 5（氯化胆碱:草酸，1:1）在800 W功率下进行提取，优化水含量（20–50%）、时间（10–45分钟）和温度（30–80°C）。4）**高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）**：对提取液中的花青素进行定性和定量分析。葡萄皮样本来自2023年9月西班牙拉格拉哈（La Grajera）庄园的丹魄（Tempranillo）葡萄品种，经压榨、干燥、筛分后冷冻保存。

#### 研究结果

**3.1 COSMO-RS模拟**
通过计算30,132种DES组合中Mal-3G和Mal-3G-cou的ln γ^∞值，发现最有效的HBA包括氯化胆碱、乙酸钠、丙酸钠和碳酸钾，最有效的HBD包括多元醇（甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,6-己二醇）和羧酸（柠檬酸、苹果酸、乳酸、草酸）。糖类和脂肪酸类HBD的γ^∞值较高，溶解能力较差。氯化胆碱作为HBA比甜菜碱更有效。

**3.2 提取物中花青素的鉴定**
通过UPLC-MS/MS鉴定出葡萄皮提取物中的主要花青素：Del-3G、Pet-3G、Peo-3G、Mal-3G以及Mal-3G-cou、Mal-3G-ace、Mal-3G-caf、Cya-3G-cou、Pet-3G-cou等酰化衍生物。

**3.3 选定DES的实验性能**
实验比较了15种DES（含30 wt%水）与甲醇/水/甲酸传统溶剂的提取效果。DES 1（氯化胆碱:乙二醇）、DES 2（氯化胆碱:1,2-丙二醇）、DES 4（氯化胆碱:甘油）和DES 5（氯化胆碱:草酸）的提取量最高。多元醇类HBD优于羧酸类HBD，烷基链越长提取效果越差。甘油比乙二醇更有效地提取Mal-3G，但乙二醇对Mal-3G-cou更有效。碳酸钾基DES（DES 13、14）虽然理论γ^∞值低，但实际提取量未显著提高，归因于需要酸性pH促进花青素释放。

**3.4 提取参数优化**
**3.4.1 超声辅助提取**：针对DES 4，响应面法优化表明，水含量（20%）和时间（60分钟）是显著因素，低水含量和长时间有利于提取。最佳条件下Mal-3G和Mal-3G-cou的提取量分别约为135 mg/kg和80 mg/kg。
**3.4.2 微波辅助提取**：针对DES 5，优化表明温度（45°C）是主要因素，高于80°C会导致花青素降解。最佳条件为20 wt%水、27.5分钟、45°C。Mal-3G提取量达172 ± 7 mg/kg，较传统方法提高64%。超声辅助提取（DES 4）在60分钟、20 wt%水条件下Mal-3G提取量为119.5 ± 0.5 mg/kg，提高13%。两种方法均显著优于传统溶剂（p<0.05），仅Peo-3G和Mal-3G-cou例外。

#### 总结与结论

**讨论总结**：本研究证明，结合计算机模拟（COSMO-RS）与实验设计（DoE）可高效筛选DES并优化提取条件。实验发现，氯化胆碱与多元醇或草酸组合的DES效果最佳，而碳酸钾基DES因无法提供酸性环境而提取效率有限。水含量需控制在20 wt%左右以平衡粘度和溶解性，过高会降低极性花青素的溶解度。微波辅助提取在更短时间（27.5分钟 vs 60分钟）和较低温度（45°C vs 室温）下获得更高产量，且避免了高温降解。

**研究结论翻译**：
在这项工作中，使用低共熔溶剂提高了红葡萄皮中花青素的提取产量。结合计算与实验的方法使得溶剂系统的选择得以实现，减少了实验工作量并提高了过程效率。计算研究表明，Mal-3G和Mal-3G-cou在碳酸钾、乙酸钠和丙酸钠中的溶解度高于在氯化胆碱和甜菜碱基DES中的溶解度。然而，碳酸钾与甘油（DES 13和DES 14）并未表现出显著高于其他溶剂的提取产量，因为从生物质中提取花青素似乎需要酸性条件。实验发现，氯化胆碱作为HBA比甜菜碱更有效地提取花青素。此外，多元醇作为HBD比羧酸（柠檬酸、乳酸、苹果酸）效果更好。HBD的烷基链长度也影响提取产量，较长的烷基链对花青素提取产量有不利影响。实验研究中最佳提取产量来自氯化胆碱:草酸和氯化胆碱:甘油。对于微波辅助提取，最佳参数为45°C、27.5分钟和20 wt%水，而对于超声辅助提取，最佳条件为60分钟和20 wt%水。本研究是对DES作为提取剂效能的前瞻性分析，旨在评估其当前性能并探索未来潜在应用。为此，不仅要评估其提取效率，还需考虑稳定性、毒性和环境影响等因素，这些方面对于评估其在化妆品、制药和食品工业中的未来适用性至关重要。