《Cellular Signalling》：NOV promotes renal ischemia-reperfusion injury by driving TFRC-dependent ferroptosis
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摘要急性肾损伤是一种严重的临床综合征，目前治疗手段有限，其背后的分子机制也尚未完全阐明。肾母细胞瘤过表达蛋白NOV是一种基质蛋白，已被认为与肾脏病理生理过程有关，但其在急性肾损伤中的作用仍不明确。通过小鼠肾缺血再灌注模型以及处于缺氧/复氧状态下的HK-2细胞实验，我们发现急性肾损
摘要
急性肾损伤是一种严重的临床综合征，目前治疗手段有限，其背后的分子机制也尚未完全阐明。肾母细胞瘤过表达蛋白NOV是一种基质蛋白，已被认为与肾脏病理生理过程有关，但其在急性肾损伤中的作用仍不明确。通过小鼠肾缺血再灌注模型以及处于缺氧/复氧状态下的HK-2细胞实验，我们发现急性肾损伤早期，肾小管上皮细胞中会迅速表达NOV。特异性敲低RTEC中的NOV可显著减轻缺血再灌注后的肾功能障碍和管状损伤。转录组分析表明，铁死亡是受NOV调控的重要途径。事实上，无论在体内还是体外环境中，敲低NOV都能降低脂质过氧化、铁积累以及与铁死亡相关的损伤。在缺氧复氧条件下，NOV过表达会增加细胞对铁死亡的易感性，而ferrostatin-1则能缓解这一效应。从机制上来看，NOV与转铁蛋白受体相互作用，通过减少K48位点的泛素化来稳定该受体，从而促进铁死亡。研究还发现NEDD4L可能是介导转铁蛋白受体泛素化的E3连接酶，而NOV会干扰NEDD4L对转铁蛋白受体K48位点的泛素化作用。综上，这些研究结果表明NOV与转铁蛋白受体构成的轴系是调控铁死亡性管状损伤的关键因素，也为将NOV作为急性肾损伤的治疗靶点提供了依据。
引言
急性肾损伤是一种以肾功能下降为特征的临床综合征，会导致较高的死亡率，并增加患慢性肾病的风险[1]、[2]、[3]。肾缺血再灌注损伤是引发急性肾损伤的主要原因之一[4]，其特点包括肾小管上皮细胞损伤、氧化应激以及炎症细胞浸润[5]、[6]。目前对于缺血再灌注性急性肾损伤中肾小管上皮细胞损伤的机制仍不完全清楚，这也限制了有效药物干预方法的研发。
肾母细胞瘤过表达蛋白NOV，又称CCN3，属于CCN家族的分泌型基质蛋白，能够调控细胞的增殖、分化以及炎症反应[7]、[8]。先前的研究表明，CCN家族蛋白在肾脏损伤与修复过程中起着重要作用[9]、[10]、[11]、[12]。我们的最新研究显示，在急性肾损伤的早期阶段，NOV及其同属该家族的CCN1蛋白的表达都会上升[10]、[12]，这表明CCN家族蛋白可能参与了急性肾小管应答过程。越来越多的证据也表明NOV与肾脏病理生理过程密切相关，尤其是在纤维化及炎症反应方面[13]、[14]、[15]，不过它在急性肾损伤中的作用至今尚未被深入研究。
有新的研究证据表明，NOV会在代谢性疾病和心血管疾病中通过增加活性氧的生成而加剧氧化应激[16]、[17]。氧化应激和氧化还原失衡会引发肾小管上皮细胞损伤以及铁死亡——这是一种依赖铁离子的程序性细胞死亡形式，已被认为是缺血再灌注性急性肾损伤中肾小管上皮细胞丢失的重要机制[5]。抑制铁死亡能够减轻管状损伤并促进肾脏修复[20]，但目前尚未完全明确控制肾小管细胞中铁死亡的上游调控机制。
在本研究中，我们探讨了NOV在缺血再灌注性急性肾损伤中的作用，并研究了它与铁死亡之间的关联。通过体内和体外模型，我们发现NOV在受损的肾小管上皮细胞中可作为早期应答蛋白存在，且会促进与铁死亡相关的管状损伤。从机制层面来看，NOV与转铁蛋白受体相互作用，通过抑制该受体的泛素化降解来稳定其功能，进而增加细胞内的铁积累并促进铁死亡。进一步的研究还发现NEDD4L可能是参与转铁蛋白受体泛素化的E3连接酶，这一发现为解释NOV在急性肾损伤期间如何调控转铁蛋白受体稳定性提供了可能机制。
章节要点
缺血再灌注性急性肾损伤时肾小管上皮细胞中NOV的表达升高
为了了解急性肾损伤过程中NOV的表达动态变化，我们建立了双侧肾缺血再灌注损伤的小鼠模型，再灌注时间分别为6小时和24小时（见图1A）。生化检测结果显示，缺血再灌注后6小时，肌酐和血尿素氮的水平就开始上升，24小时时进一步升高，这表明肾功能正在逐渐恶化（见图1B）。苏木精伊红染色结果显示，缺血再灌注后出现了典型的肾小管损伤特征，包括肾小管上皮细胞...
讨论
在本研究中，我们发现NOV是缺血再灌注性急性肾损伤期间肾小管上皮细胞中铁死亡的一个此前未被认识到的调控因子。我们证实，缺血应激发生后，RTEC中会迅速表达NOV，而特异性清除这些细胞中的NOV能够显著减轻肾脏损伤。此外，无论在体外还是体内实验中，敲低NOV都能降低脂质过氧化、铁过度积累以及其他与铁死亡相关的改变。从机制上看，NOV是通过稳定转铁蛋白受体来促进铁死亡的...
结论
总之，我们的研究结果表明NOV是缺血再灌注性急性肾损伤中铁死亡性管状损伤的调控因子。NOV通过稳定转铁蛋白受体，促进依赖该受体的铁积累以及氧化还原失衡，这一过程很可能与它抑制NEDD4L对转铁蛋白受体K48位点的泛素化作用有关。这些发现支持了NOV与转铁蛋白受体构成调控轴系在肾铁死亡中的作用，也为将NOV作为急性肾损伤的治疗靶点提供了理论依据。
动物模型
实验所用C57BL/6品系雄性小鼠，年龄在6到8周之间，购自中国济南鹏跃实验动物有限公司。按照先前描述的方法[38]、[39]，对这些小鼠进行了双侧肾缺血再灌注损伤手术。具体操作为：给小鼠腹腔内注射浓度为0.5%的戊巴比妥钠，剂量为50毫克/千克，使其进入麻醉状态，随后在背部皮肤切开一个切口以暴露两只肾脏。接着使用德国Roboz Surgical Instrument公司的血管夹夹住肾脏的肾蒂，持续30分钟...
数据与材料的获取情况
本研究过程中生成和/或分析的所有数据集，如需获取，可向通讯作者提出合理请求后获得。
CRediT作者贡献说明
辛彦璐：负责原始稿件撰写、方法学设计、概念构思工作。孙晓：负责软件应用、数据整理工作。张宁欣：负责实验验证、相关研究工作。关晨：负责稿件审阅与编辑、研究指导工作。王丽婷：负责项目管理工作。丁伟：负责正式数据分析工作。顾明豪：同样负责正式数据分析工作。宋卓：负责结果可视化、相关研究工作。赵瑞哲：同样负责结果可视化、相关研究工作。王新宁：负责资源协调工作。徐岩：负责稿件审阅与编辑、项目管理工作以及资金筹集工作。
利益冲突声明
作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：徐岩表示其研究工作得到了青岛大学附属医院的资助。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
资金支持
本研究得到了以下机构的资助：中国国家自然科学基金，项目编号为82470722和82270724；青岛市科技惠民专项计划，项目编号为26-1-5-smjk-4-nsh；以及山东省泰山学者计划，项目编号为tstp20230665。所有资助机构均未对本研究的设计、数据收集与分析、论文发表决策或手稿准备过程施加任何影响。作者们的贡献情况如下。
辛彦璐|孙晓|张宁欣|关晨|王丽婷|丁伟|顾明豪|宋卓|赵瑞哲|王新宁|徐岩
中国山东省青岛市江苏路16号，青岛大学附属医院肾病科，邮编266003
