蚯蚓（Eisenia fetida）暴露于噻草酮的生物学和代谢响应

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Biological and metabolism responses of earthworm ( Eisenia fetida) exposed to metribuzin

　　

噻草酮（metribuzin）是一种广泛使用的三嗪类除草剂，其在水生生物中的毒性效应已被广泛研究，但对土壤生物，特别是蚯蚓的影响仍了解不足。本研究调查了噻草酮对蚯蚓（Eisenia fetida）的生态毒性，重点关注生长抑制、氧化应激和代谢改变。研究人员将蚯蚓暴露于浓度为0、5、10和20?mg·kg^?1的噻草酮的人工土壤中，为期28天。结果表明，噻草酮暴露显著抑制了蚯蚓的生长，最高浓度（20?mg·kg^?1）下效果最明显。噻草酮诱导的氧化应激通过升高的活性氧（ROS）水平和降低的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性得以证实。此外，噻草酮暴露增加了丙二醛（MDA）和8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG）的水平，表明脂质过氧化和DNA损伤增强。综合生物标志物响应指数版本2（IBRv2）分析表明氧化应激呈剂量依赖性增加，确定ROS和8-OHdG为最敏感的生物标志物。代谢组学分析揭示了代谢途径的显著紊乱，特别是与氨基酸代谢、三羧酸（TCA）循环和谷胱甘肽代谢相关的途径。这些发现表明噻草酮对土壤生态系统具有潜在的毒理学风险，并强调了将土壤生物纳入除草剂风险评估的重要性。

**论文解读：噻草酮对蚯蚓（Eisenia fetida）的生物学与代谢响应机制**

**研究背景与问题**
除草剂在保障粮食产量中发挥关键作用，但过度使用引发环境风险。噻草酮（metribuzin）是一种不对称三嗪类除草剂，通过抑制光合系统II电子传递防治杂草，广泛用于作物播前和播后除草。由于其水溶性高（1165?mg·L^?1，20℃）和吸附系数低，土壤残留噻草酮易通过降水淋溶进入水环境，已在葡萄牙和丹麦的地下水样本中检出。尽管已有研究关注噻草酮对水生生物（如藻类、鱼类）的毒性，但其对土壤生物，尤其是蚯蚓的影响尚不明确。蚯蚓（Eisenia fetida）作为土壤生态系统的关键指示生物，被经济合作与发展组织（OECD）推荐用于土壤污染研究（Bao等，2023）。因此，有必要系统评估噻草酮对蚯蚓的生态毒性及其机制，为土壤环境风险评估提供依据。该论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

**研究内容与结论**
研究人员选取成年蚯蚓（Eisenia fetida，体重500–600?mg），通过人工土壤法暴露于0、5、10、20?mg·kg^?1噻草酮28天，测定个体水平（体重）、生化水平（活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、8-羟基-2′-脱氧鸟苷（8-OHdG））及代谢组学变化。结果发现：噻草酮显著抑制蚯蚓生长，最高浓度组28天体重抑制率达41.10%；ROS水平升高，SOD、CAT、POD活性降低，MDA和8-OHdG含量增加，表明氧化应激和DNA损伤；综合生物标志物响应指数版本2（IBRv2）分析显示剂量依赖性毒性增强，ROS和8-OHdG为最敏感生物标志物；代谢组学揭示氨基酸代谢、三羧酸（TCA）循环、谷胱甘肽代谢等途径紊乱，关键代谢物如L-谷氨酸、柠檬酸、亚精胺等显著下调。研究证实噻草酮通过“氨基酸代谢紊乱-能量代谢抑制-抗氧化防御衰竭”复合机制对蚯蚓产生毒性，强调了将土壤生物纳入除草剂风险评估的必要性。

**关键技术方法**
1. **人工土壤暴露实验**：依据OECD Guideline No. 222，人工土壤由70%石英砂、20%高岭土、10%新鲜泥炭组成，pH调至6.5±0.5。蚯蚓来源：河北省石家庄市蚯蚓养殖场，驯化两周后选择体重相近的个体。
2. **生化指标测定**：使用商业试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定总蛋白（TP）、ROS、SOD、CAT、POD、MDA和8-OHdG。ROS采用DCFH-DA荧光探针法；SOD、CAT、POD活性基于比色法；MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）法；8-OHdG采用酶联免疫吸附法（ELISA）。
3. **代谢组学分析**：选取28天20?mg·kg^?1处理组（n=6）进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。使用UHPLC-Q Exactive系统（Thermo Fisher Scientific），ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100?mm×2.1?mm，1.8?μm），正负离子模式电喷雾电离（ESI）。数据经Progenesis QI预处理，归一化后通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和变量重要性投影（VIP）筛选差异代谢物，并通过KEGG、HMDB数据库进行通路富集分析。

**研究结果**
**3.1 蚯蚓生长**：通过每周称重发现，暴露7天时各处理组与对照组无显著差异；21–28天时，所有处理组体重抑制率显著高于对照组（p<0.05），且呈剂量-时间依赖性。28天时，20?mg·kg^?1组抑制率达41.10%。
**3.2 ROS含量**：采用DCFH-DA荧光探针测定，7天时高剂量组（10–20?mg·kg^?1）ROS显著升高；14天和28天时，所有处理组ROS均显著高于对照组，28天20?mg·kg^?1组为对照的1.48倍，表明氧化应激持续存在。
**3.3 抗氧化酶活性**：SOD、CAT、POD活性总体呈下降趋势。7天时仅20?mg·kg^?1组SOD显著降低；14–28天，所有处理组SOD活性均显著低于对照组，28天20?mg·kg^?1组降至对照的56.09%。CAT和POD在5?mg·kg^?1组7天时略有升高，但随后持续下降，28天时各处理组CAT和POD活性均显著低于对照（P<0.05）。
**3.4 MDA和8-OHdG含量**：MDA含量随暴露时间和浓度增加，28天20?mg·kg^?1组为对照的1.61倍，表明脂质过氧化加剧。8-OHdG在21天达到峰值，20?mg·kg^?1组为对照的1.46倍，随后下降，提示DNA损伤后期可能伴随修复能力减弱或代谢活性降低。
**3.5 IBRv2比较**：整合ROS、SOD、CAT、POD、MDA、8-OHdG六项指标，IBRv2值随浓度增加而升高，7–14天迅速上升，21–28天趋于稳定。ROS和8-OHdG被识别为最敏感生物标志物，贡献最大。
**3.6 蚯蚓代谢**
**3.6.1 代谢产物改变**：OPLS-DA显示处理组与对照组代谢谱显著分离，VIP>1.5筛选出10种差异代谢物，包括谷氨酰丝氨酸、单萜苷、kukoamine B等。
**3.6.2 代谢途径紊乱**：KEGG分析显示丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径受影响最大（影响值最高，p值最低），精氨酸生物合成、嘌呤代谢、维生素B₆代谢、谷胱甘肽代谢和TCA循环均显著紊乱。关键代谢物如L-谷氨酸、草酰乙酸、柠檬酸、琥珀酸、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）显著降低，亚精胺（谷胱甘肽代谢途径）显著下调，4-吡哆酸和5-吡哆醛内酯（维生素B₆代谢）亦显著降低。

**讨论与结论**
讨论部分指出，蚯蚓体重抑制与能量消耗性解毒过程有关；ROS升高触发抗氧化系统响应，但持续高浓度暴露导致酶活性抑制，脂质过氧化（MDA升高）和DNA损伤（8-OHdG升高）表明氧化损伤累积。IBRv2的稳定趋势提示初期适应反应或抗氧化能力耗竭。代谢组学揭示的“氨基酸代谢-能量代谢-抗氧化防御”多靶点毒性特征，与已有研究（如阿特拉津）一致。结论部分翻译如下：
在本研究中，研究人员全面评估了噻草酮对蚯蚓（Eisenia fetida）的生物学和代谢响应。结果表明，噻草酮胁迫诱导了显著的氧化应激和代谢紊乱，导致生长抑制、体重减轻和细胞损伤。生理生化紊乱的严重程度呈浓度依赖性。升高的ROS水平、降低的抗氧化酶活性以及增强的脂质过氧化和DNA损伤共同表明氧化损伤。IBRv2指数显示氧化应激呈剂量依赖性增加，ROS和8-OHdG被确定为最敏感的生物标志物。此外，代谢组学分析显示关键代谢途径发生显著改变，包括能量代谢、氨基酸合成和抗氧化代谢，进一步说明了噻草酮对蚯蚓生理学的广泛影响。这些发现为噻草酮的环境风险提供了更深入的见解，并强调了在土壤生态系统中进行更全面的除草剂毒性评估的必要性。