基于猪黏膜模型的鼠李糖乳杆菌GG微胶囊消化触发释放与黏膜黏附的离体评价

《Food Bioscience》：EX VIVO EVALUATION OF DIGESTION-TRIGGERED RELEASE AND MUCOADHESION OF MICROENCAPSULATED LACTOBACILLUS RHAMNOSUS GG USING A PORCINE MUCOSAL MODEL

　　

尽管在改善益生菌胃肠道（gastrointestinal，GI）存活率的微胶囊化方面取得了显著进展，但直接评价封装益生菌能否在生理相关条件下存活消化、在靶标肠道位点释放并随后黏附于黏膜表面的方法仍有限。本研究开发了一种离体（ex vivo）猪黏膜流动模型，作为评价鼠李糖乳杆菌GG（LRGG）胃肠保护、消化触发释放及消化后黏膜黏附的实用平台。研究了三种基于乳液（emulsion-based）的微胶囊体系：水包油包水（water-in-oil-in-water，W/O/W）双重乳液（MD）、外凝胶化微胶囊（ME）以及双重乳液联合外凝胶化微胶囊（MDE）。定量表征了模拟胃肠消化前后的黏膜黏附性能，并辅以共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）和扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM）进行结构与黏附可视化。游离LRGG在模拟胃环境中迅速失活，而凝胶化微粒较基于大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）的双重乳液体系（MD）表现出显著增强的保护作用。胃消化期间，ME与MDE维持结构完整性并保留高黏附活菌密度（>6.0 Log10 CFU/cm2），MD则活力与黏附大幅降低（<3.0 Log10 CFU/cm2）。模拟肠条件下，ME与MDE基质快速崩解，实现消化触发益生菌释放并增强黏膜互作，经CLSM与SEM确认。结果表明胶囊构型影响益生菌保护、释放行为及消化后黏膜黏附；所建离体评价平台为筛选口服靶向递送系统及优化益生菌微胶囊配方以提升滞留与定殖提供了直接高效工具。

研究背景与立项依据

口服益生菌须耐受胃肠道（gastrointestinal，GI）上部酸性、酶解与胆盐应激，抵达下肠道上皮后方能借由黏膜黏附延长滞留并促进宿主—微生物互作。游离鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LRGG）在胃液（pH 2.5）中1 h内即低于检测限（<2.0 Log₁₀ CFU/g）。微胶囊化是主流防护策略，常用水包油包水（water-in-oil-in-water，W/O/W）双重乳液、外凝胶化（external gelation）及二者杂化体系；壁材常选大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）与钙—海藻酸钠（sodium alginate，SA）交联网络。既有研究多聚焦存活率，忽视“消化—囊体降解—益生菌释放—黏膜黏附”的联动评价；常规体外黏附模型（上皮细胞单分子层、黏蛋白包被板）难以还原肠黏膜拓扑与流动条件。研究人员因此建立离体（ex vivo）猪回肠黏膜流动模型，整合序贯体外消化与流动黏附定量（黏附活菌密度 Adhered Viable Cell Density、黏附指数 Mucoadhesion Index），并以共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）与扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM）佐证，该文发表于《Food Bioscience》。

主要关键技术方法

研究人员采用美国佐治亚大学屠宰场三头健康成年猪回肠黏膜（约60片，2 cm×2 cm，-80 ℃冻存备用）作为离体底物；构建三种乳液微胶囊——W/O/W双重乳液（MD）、W/O乳化+Ca²⁺外凝胶化（ME）、W/O/W+外凝胶化（MDE），壁材为SPI与SA、油相为大豆油含Tween 80；开展静态序贯消化（模拟胃液 pH 2.5、2 h；模拟肠液 pH 8.1、4 h）；以1 mL/min、45°倾角将样本加于固定黏膜的流动台，依物料衡算推黏附活菌密度与黏附指数；CLSM用Hoechst 33342（蓝）、Fast Green FCF标记SPI（粉）、Coumarin 6标记油相（绿）追踪结构演化；SEM可变压力模式观察冻干黏膜—胶囊互作；ANOVA（Tukey HSD，p<0.05）处理三重重复数据。

研究结果

3.1 模拟胃肠液中游离与微囊化LRGG存活

游离LRGG胃液1 h即不可检出。胃期末ME（7.26±0.26 Log₁₀ CFU/g）与MDE（7.14±0.32）无差异且显著高于MD（4.22±0.27）；肠期6 h末ME（4.09±0.48）与MDE（4.41±0.17）仍高于MD（3.12±0.13）。SA—Ca²⁺凝胶在酸中收缩成核壳屏障，肠液碱性下去质子化脱钙而崩解，实现pH触发释放；MD因缺凝胶层，酸与胆盐协同致活菌骤降。

3.2 离体猪黏膜模型黏附性能

未消化时游离LRGG黏附密度7.28±0.22 Log₁₀ CFU/cm²、指数0.94；ME最高（7.82±0.14，0.98），MDE次之（7.43±0.15，0.95），MD最低（6.81±0.19，0.89），SA羧基与黏蛋白氢键贡献明确。胃消化后ME（6.02±0.28）与MDE（6.11±0.39）维持>6.0 Log₁₀ CFU/cm²，MD跌至2.39±0.22；全消化末MDE（3.21±0.19）与ME（2.90±0.52）仍高于MD（2.06±0.15）。宏观见ME/MDE在胃酸中留膜于黏膜，肠液中溶解消失；质量衡算法未标准化冲洗，数值属表观滞留。

3.3 CLSM与SEM分析

CLSM示MD在胃期乳液部分塌缩、肠期SPI信号消失油相锐减；ME/MDE胃期边界完整（SA酸中失负电收缩），肠期4 h全溶、蓝光菌细胞释出。SEM示游离LRGG各期均有杆状结构贴黏膜（胃后活菌虽未检出，死菌亦可附着）；MD未消化与胃期为膜状覆盖、无散在菌，肠期膜消且菌现；ME/MDE胃期颗粒贴膜、无释放，肠期粒溶、少量菌附组织。SEM不能区分死活，冻干或改 hydration 态，故需与定量指标联用。

讨论与结论翻译

讨论指出，胶囊架构同时决定防护、触发释放与消化后黏附效率；外凝胶化体系借SA物理黏附与pH敏感凝胶化兼顾上位保护与前肠滞留、下位崩解释菌。离体猪黏膜流动模型以Adhered Viable Cell Density与Mucoadhesion Index双指标弥补传统体外法缺陷，比体内试验简便直接。

结论（译）：本研究论证了离体猪黏膜模型在评价益生菌微胶囊黏膜黏附中的效用，同步阐明不同递送体系在胃肠消化中的行为动力学；ME与MDE较游离LRGG及SPI-only双重乳液MD显著耐受GI应激，CLSM与SEM可视化与定量黏附结论机理一致；该离体框架为设计、筛选及比较益生菌口服靶向微胶囊提供了较现有方法更简便直接的工具。

（全文约1520汉字，所有数据、术语、作者名 Toshifumi Udo、Fanbin Kong 等均本自上传文稿，无外推。）