通过有机酸和热处理控制常温酸性乳制品中酸土脂环酸芽孢杆菌孢子和丝衣霉子囊孢子生长的研究

《Food Microbiology》：Control of Alicyclobacillus acidoterrestris spore and Byssochlamys ascospore growth in ambient acid dairy products through organic acid and heat treatments

　　

摘要：孢子形成微生物在常温酸性乳制品中构成显著的腐败风险。该研究调查了在常温酸性乳制品相关条件（pH 4.6）下，有机酸和热处理单独及联合使用对控制酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）孢子和丝衣霉（Byssochlamys）子囊孢子的效果。山梨酸钾（Potassium Sorbate, PS）在测试的有机酸中表现出第二高的抗菌效力，对酸土脂环酸芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.8-1.6 mg/mL，对丝衣霉属菌种为0.8 mg/mL。在肉汤中，研究人员发现PS ≥ 0.5 mg/mL单独使用或与本研究采用的任何热处理组合，在25 °C和40 °C下有效控制了酸土脂环酸芽孢杆菌孢子的萌发和生长。在25 °C储存时，控制丝衣霉子囊孢子需要0.8 mg/mL PS单独使用，或0.5 mg/mL PS与热处理（85 °C 10分钟）或热处理（95 °C 30秒）联合使用；但在45 °C储存时，PS（0.5 mg/mL或0.8 mg/mL）单独使用或热处理（95 °C 30秒）单独使用即足够。在饮用酸奶中的验证研究证实，PS单独使用（0.5 mg/mL或0.8 mg/mL）在40 °C下可防止酸土脂环酸芽孢杆菌生长，而仅0.8 mg/mL PS与75 °C 20分钟热处理联合使用，才能在40 °C储存12周后完全抑制浅黄丝衣霉（B. fulva）子囊孢子。这些发现为保障常温酸性乳制品对抗耐热腐败微生物的微生物稳定性提供了一种实用的多屏障策略。

**研究背景与问题**
常温酸性乳制品（如长保质期酸奶饮）因其便捷性和无需冷藏特性，在近年来市场份额迅速增长。然而，这类产品面临耐热孢子形成微生物的严重腐败风险。酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）是一种嗜热嗜酸菌，能在pH 2-6.5和20-70 °C范围内生长，其孢子具有高耐热性，常污染果汁和浓缩物，并可经水果配料进入乳制品，产生异味物质。丝衣霉属（Byssochlamys）如浅黄丝衣霉（B. fulva）和雪白丝衣霉（B. nivea）能产生高度耐热的子囊孢子，可在低氧和低pH条件下生长，导致产品结构软化、产气及异味。传统巴氏杀菌不足以灭活这些孢子，而更高强度的热处理会损害产品营养、质构和风味，并增加能耗。因此，需要开发低强度热处理与有机酸等“屏障”相结合的联合控制策略，以在保持微生物稳定性的同时满足消费者对“温和加工”和清洁标签的需求。本研究旨在系统评估有机酸（乳酸、柠檬酸、山梨酸钾、苯甲酸钾）及热处理单独和联合使用对酸土脂环酸芽孢杆菌孢子和丝衣霉子囊孢子的控制效果，为常温酸性乳制品的工艺设计提供依据。该论文发表在《Food Microbiology》。

**关键技术与方法**
研究人员采用以下主要技术方法：（1）最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定：使用微量肉汤稀释法及浊度检测，在pH 4.6的胰酪大豆胨肉汤（TSB）中评估四种有机酸对酸土脂环酸芽孢杆菌四个菌株（DSM 2498、DSM 3922、DSM 3923、DSM 3924，均来自德国DSMZ）的抗菌活性；对丝衣霉子囊孢子采用目视生长评估法（5天培养后观察菌丝）测定MIC。（2）孢子制备：酸土脂环酸芽孢杆菌孢子通过BAT琼脂平板培养7天、80 °C热处理10分钟激活后纯化；丝衣霉子囊孢子通过麦芽汁琼脂（MEA）或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养30天、水洗及过滤制备。（3）联合处理实验：在TSB（pH 4.6）中，设置三种热处理（75 °C 20分钟、85 °C 10分钟、95 °C 30秒）与不同浓度乳酸（0.8%）、山梨酸钾（0.05%或0.08%）单独或组合，接种孢子（约10⁴ CFU/mL）后于25 °C和40 °C储存12周，通过光密度（OD₅₉₅）和涂板计数监测生长；丝衣霉还需在低氧（<1% O₂）条件下验证。（4）酸奶验证：采用商业化配方饮用酸奶（pH 4.6），添加不同浓度山梨酸钾（0.05%和0.08%），接种孢子后经热处理（75 °C 20分钟或85 °C 10分钟），于25 °C和40 °C储存12周，通过涂板计数（酸土脂环酸芽孢杆菌）和目视检查菌丝（丝衣霉）评估抑制效果。

**研究结果**
**3.1 有机酸对酸土脂环酸芽孢杆菌的MIC和MBC**
通过微量肉汤稀释法测定，研究人员发现乳酸（LA）对所有四个菌株的MIC均为8 mg/mL（0.8%），但MBC在10-48 mg/mL间波动，表明菌株间存在差异。柠檬酸（CA）的MIC最高（22-44 mg/mL），抗菌活性最弱。山梨酸钾（PS）的MIC为0.8-1.6 mg/mL，苯甲酸钾（PB）的MIC最低（0.4-0.8 mg/mL），但PB在发酵乳制品中缺乏欧盟许可限量。PS的MIC（0.8 mg/mL）符合欧盟对未调味发酵乳制品中山梨酸盐的最大限量（1 mg/mL）。

**3.2 有机酸对丝衣霉子囊孢子的MIC**
在TSB（pH 4.6）中30 °C培养5天后，LA和CA对浅黄丝衣霉和雪白丝衣霉的MIC均>100 mg/mL，表明无实际抑制效果。PS对两种菌的MIC均为0.8 mg/mL，PB对浅黄丝衣霉和雪白丝衣霉的MIC分别为1.6 mg/mL和3.2 mg/mL，PS是效果最优的有机酸。

**3.3 乳酸、山梨酸钾和热处理对酸土脂环酸芽孢杆菌孢子生长的影响**
在肉汤系统中，单独热处理（75 °C 20分钟、85 °C 10分钟、95 °C 30秒）均不能抑制孢子萌发。单独LA（0.8%）在25 °C下可抑制生长，但在40 °C下无效。LA与85 °C 10分钟或95 °C 30秒联合使用，在两种温度下均实现完全抑制，显示协同效应。PS ≥ 0.5 mg/mL单独或与任何热处理组合，无论是否含LA，在25 °C和40 °C下均能完全抑制孢子生长12周，表明PS在不同温度下均保持高效抗菌活性。

**3.4 山梨酸钾和热处理对丝衣霉子囊孢子生长的影响**
在好氧和低氧（<1% O₂）条件下，浅黄丝衣霉子囊孢子对热处理和PS更耐受。单独75 °C 20分钟或85 °C 10分钟不能抑制其生长；95 °C 30秒单独处理有效。0.5 mg/mL PS单独使用在25 °C下无效，在40 °C下有效；0.8 mg/mL PS单独使用在所有条件下均完全抑制生长。0.5 mg/mL PS与85 °C 10分钟联合在25 °C下有效，但75 °C 20分钟联合无效。雪白丝衣霉子囊孢子更敏感：85 °C 10分钟单独处理即可抑制；0.5 mg/mL PS单独使用在所有条件下均有效。因此，控制两种丝衣霉的推荐方案为0.8 mg/mL PS联合75 °C 20分钟，或0.5 mg/mL PS联合85 °C 10分钟。

**3.5 在饮用酸奶中验证联合处理**
在饮用酸奶（pH 4.6，含天然乳酸约0.53%）中，酸土脂环酸芽孢杆菌孢子在25 °C下所有处理组（包括未处理对照）均未萌发，表明基质本身乳酸含量足以维持孢子休眠。在40 °C下，对照和单独热处理组孢子数从10⁴ CFU/mL增至10⁷ CFU/mL，而PS（0.5或0.8 mg/mL）单独或联合热处理均完全抑制生长，表明PS是主导抑制因素。对于浅黄丝衣霉子囊孢子，在25 °C下所有处理（包括0.8 mg/mL PS+75 °C 20分钟）均未能阻止生长，显示该温度下控制难度极大。在40 °C下，仅0.8 mg/mL PS联合75 °C 20分钟处理实现12周完全抑制，其他处理（包括0.5 mg/mL PS+85 °C 10分钟）均出现生长，表明联合处理中PS浓度是关键因素。

**讨论与结论**
讨论部分强调，有机酸（尤其是PS）在pH 4.6时以未解离形式发挥主要抗菌作用，其pKa值为4.76，在此pH下约50%处于未解离态，有利于穿透微生物细胞膜。PS对酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制效果优于乳酸和柠檬酸，且温度影响显著：在40 °C下PS单独使用即可控制孢子，而乳酸需结合热处理才能生效。对于丝衣霉，子囊孢子的多层结构赋予其高耐受性，但PS与热处理的协同作用可克服这一屏障。在酸奶验证中，25 °C下浅黄丝衣霉的持续生长表明，现有处理强度不足以应对常温储存，可能需要更高浓度PS或更强烈热处理（如95 °C 30秒），但需考虑产品感官和法规限制。研究结论如下：
本研究系统评估了乳酸、柠檬酸、山梨酸钾和苯甲酸钾单独及与热处理联合，在常温酸性乳制品配方、加工和储存条件下对酸土脂环酸芽孢杆菌孢子和丝衣霉子囊孢子的抗菌效果。山梨酸钾在pH 4.6下对两种腐败菌均有效，且优于乳酸和柠檬酸。在肉汤系统中，PS ≥ 0.5 mg/mL单独或联合热处理可有效控制酸土脂环酸芽孢杆菌孢子萌发。控制丝衣霉子囊孢子在25 °C储存时需要0.8 mg/mL PS单独使用，或0.5 mg/mL PS联合热处理（85 °C 10分钟），或95 °C 30秒单独热处理；在40 °C储存时，PS（0.5或0.8 mg/mL）单独或95 °C 30秒单独热处理即足够。在商业化饮用酸奶中的验证结果证实了两种联合屏障方案的实际适用性：0.5 mg/mL PS+85 °C 10分钟和0.8 mg/mL PS+75 °C 20分钟。两种策略在40 °C下储存12周均完全防止了酸土脂环酸芽孢杆菌孢子萌发，而仅0.8 mg/mL PS+75 °C 20分钟实现了浅黄丝衣霉子囊孢子的长期抑制。重要的是，在25 °C酸奶中没有任何处理足以控制浅黄丝衣霉子囊孢子，突显了该菌在常温储存下的特殊挑战，需要进一步研究更强烈的加热方案和/或更高浓度的PS。总之，这些发现表明，将PS ≥ 0.08%与相容热处理相结合的多屏障方法，是控制常温酸性乳制品中耐热腐败微生物的一种商业可行且有效的策略，为这一快速发展的产品类别提供了产品配方和工艺设计的实用指导。