《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Overcoming Thermal Barriers in DSPC Liposome Manufacturing through Temperature-Controlled Microfluidics: Process Optimization and Physicochemical and Biological Evaluation
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摘要翻译：热控制模块实现了高相变温度（high-Tm）DSPC脂质体的稳定形成。适度的聚乙二醇（PEG，3%）改善了脂质体的均一性和可重现性。优化条件获得了粒径为115–120 nm且多分散指数（PDI）低至0.16的脂质体。纯化方法影响
摘要翻译：热控制模块实现了高相变温度（high-Tm）DSPC脂质体的稳定形成。适度的聚乙二醇（PEG，3%）改善了脂质体的均一性和可重现性。优化条件获得了粒径为115–120 nm且多分散指数（PDI）低至0.16的脂质体。纯化方法影响了粒径分布和包封效率。差示扫描量热法（DSC）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）证实了双层完整性和纳米级尺寸分布。研究人员开发了一种集成温度控制模块的三入口蛇形微混合器，用于在受控热条件下可重现地合成基于DSPC的脂质体。研究人员首先研究了合成温度的影响以确定合适的加工条件，随后评估了PEG化脂质含量和脂质浓度。研究人员应用实验设计-响应面法（DoE-RSM）框架量化了流参数和胆固醇比例对脂质体尺寸和分散性的综合影响，建立了稳健的操作窗口。研究人员进行了物理化学表征（ATR-FTIR和DSC）、疏水模型化合物（阿伏苯宗、奥克立林和尼罗红）的包封、纯化方法比较以及成纤维细胞和角质形成细胞系的生物相容性评估。总之，该研究建立了一种可重现且非专有的温控微流控工作流程，用于高Tm脂质体合成，具有受控的尺寸分布，对治疗和纳米化妆品应用具有实际意义。
论文解读：温控微流控技术实现高相变温度DSPC脂质体的可控制备与系统评价
研究背景与意义
脂质体是由磷脂双分子层自组装形成的囊泡结构，因其良好的生物相容性、结构可设计性以及同时包封亲水和疏水性药物的能力，已成为药物递送和化妆品领域广泛应用的纳米载体。在经皮递送领域，脂质体能够提高维生素、类视黄醇等不稳定活性成分的稳定性并促进其在皮肤中的沉积，同时降低游离化合物的刺激性。此外，脂质体还可用于包封阿伏苯宗、奥克立林等有机紫外线吸收剂，增强其光稳定性和皮肤滞留量，并限制其向深层皮肤的渗透。脂质体系统的性能高度依赖于其理化性质，包括粒径分布、表面电荷、双层结构和膜流动性等。其中，膜流动性对脂质体形成和结构完整性起着核心作用，主要由脂质组成和胆固醇含量控制。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）是一种高相变温度（T
m ≈ 55 °C）的磷脂，在生理温度下形成刚性且稳定的双层结构，能够减少药物渗漏并提高结构完整性。然而，采用传统大批量方法（如乙醇注入法和薄膜水化法）制备DSPC脂质体面临着混合动力学控制有限、分散性宽、批次间差异大等挑战。微流控合成平台作为替代方案，能够精确控制层流、通过受控溶剂交换实现脂质快速自组装，并实现具有可调理化性质的脂质体连续生产。但对高T
m脂质体系而言，温度是关键的工艺参数，在接近或低于T
m的条件下加工会导致膜刚性增加并形成更大、更多分散的囊泡。因此，可靠的温度控制对于DSPC脂质体的可重现合成至关重要。尽管商业微流控平台已集成温度控制功能，但仍缺乏易于实施、非专有的高T
m脂质体可重现合成方法，且多采用单因素逐一优化，难以兼顾脂质组成与操作参数间的耦合效应。此外，透析是常见的纯化方法，但离心超滤和错流过滤等替代方法在文献中探讨较少。针对上述空白，研究人员将三入口蛇形微混合器与可及的温度控制模块集成，在受控热条件下实现DSPC基脂质体的可重现合成，并通过DoE-RSM框架系统优化工艺参数，开展全面的理化表征和生物相容性评价，为高T
m脂质体的制造提供了非专有的温控微流控解决方案。
研究内容与技术方法
研究人员将三入口蛇形微混合器（通道宽度300 μm，深度150 μm）与柔性加热垫和加热板相结合，构建了温控微流控合成平台。该平台通过调节施加电压控制脂质-乙醇溶液温度至DSPC相变温度以上（约60 °C），同时将微流控芯片置于70 °C加热板上维持混合区域的近等温条件。研究采用实验设计（DoE）中的Box-Behnken设计结合响应面法（RSM），以流速比（FRR）、总流速（TFR）和胆固醇比例（CR）为自变量，脂质体粒径和多分散指数（PDI）为响应变量，建立了二次多项式回归模型并进行多响应期望函数优化。表征方法包括动态光散射（DLS）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定粒径分布与浓度，透射电子显微镜（TEM）观察形态，衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析分子结构和组分间相互作用，差示扫描量热法（DSC）评估热行为，紫外-可见光谱测定包封效率，并采用PrestoBlue法在人永生化角质形成细胞（HaCaT）和原代人新生儿真皮成纤维细胞中评价细胞相容性。样本来源包括AddexBio（美国）提供的HaCaT细胞和ATCC提供的原代人成纤维细胞。
研究结果
1. 温度控制模块
加热垫电压-温度校准曲线显示，施加20 V电压可将乙醇温度升至约60 °C，高于DSPC的T
m（约55 °C）且低于乙醇沸点，同时未观察到气泡形成。与无加热条件相比，在低于T
m（15 V，约50 °C）条件下加热仅使粒径和PDI适度降低但显著减小了测量变异性；在高于T
m（20 V）条件下加热获得了最小粒径和最窄的尺寸分布。仅对注射器加热而关闭芯片加热时，粒径和PDI均增加，表明维持混合区域高温同样至关重要。因此，20 V注射器加热与芯片加热结合被选为最佳热条件。
2. 脂质浓度对粒径分布的影响
在FRR=2、TFR=2 mL·min?1、CR=35%、MR=3%条件下，当脂质浓度（LC）从1.5 mg·mL?1增至4.5 mg·mL?1时，平均粒径显著增大，归因于脂质单体供给增加促进了较大双层中间体的生长；进一步增至9 mg·mL?1时，粒径反而减小，呈现非单调趋势。同时，PDI随LC增加而逐渐增大，表明更高脂质浓度下粒径分布变宽。上述非线性效应与文献中基于DoE的微流控研究结果一致。
3. mPEG比例对粒径分布的影响
固定CR=35%、LC=4.5 mg·mL?1、TFR=4 mL·min?1、FRR=3时，MR=1%和3%的制剂呈现单峰分布，亚100 nm范围为主，平均粒径仅增加约5 nm；而MR=5%时出现明显双峰分布，包括约20–30 nm的小粒径群体和约100–150 nm的第二群体。低PEG比例下，PEG链形成水化空间位阻屏障抑制囊泡聚集；高PEG比例下，具有较大亲水头基的PEG-脂质倾向诱导正向曲率，破坏双层堆积，导致非层状聚集体（如盘状胶束和胶束）与囊泡共存。基于此，研究人员选择MR=3%用于后续实验。
4. 基于DoE-RSM的工艺优化
对15组Box-Behnken设计实验的粒径和PDI数据进行响应面分析，经变换优化后（粒径采用平方根变换，PDI采用对数变换），最终模型拟合统计为粒径R2=0.9614、调整R2=0.9227，PDI R2=0.8378、调整R2=0.7161。方差分析显示，TFR、FRR×TFR交互项和FRR2对粒径影响显著，FRR、CR和FRR2对PDI影响显著。等高线图分析表明：粒径随FRR增加而减小，在高FRR≈4时等高线曲率增大表明稳健性降低，而FRR≈3附近等高线平坦，为更稳健的操作窗口；CR对粒径影响不显著，但PDI随CR增加而降低，胆固醇的冷凝效应改善了脂质堆积均匀性并抑制融合；FRR-CR平面呈现清晰的二次行为，表明最优工艺区域来自两因素的平衡交互。以粒径>100 nm和最低PDI为优化目标，预测条件为CR=50%、FRR=2、TFR=2 mL·min?1（预测粒径119.09 nm，PDI 0.1234），实验验证得114.71±1.85 nm和PDI 0.133±0.003；二次验证条件CR=35%（预测粒径116.46 nm，PDI 0.1546），实验得116.1±3 nm和PDI 0.16±0.005，相对差异均在±8%以内，验证了模型预测的准确性。
5. ATR-FTIR与DSC表征
冻干脂质体的ATR-FTIR光谱同时保留了DSPC的C-H伸缩带（约2920和2850 cm?1）、酯羰基带（约1735 cm?1）和磷酸盐/胆碱头基带（约1250–950 cm?1），胆固醇的O-H伸缩带（3400–3500 cm?1），PEG的C-O-C伸缩带（约1100 cm?1）及HEPES的磺酸盐相关谱带，且未出现新的共价键诊断峰，证实脂质体通过物理自组装形成。对比CR=35%和50%的归一化光谱，差异谱显示50%胆固醇条件下DSPC酰基链CH?伸缩和酯羰基的相对贡献降低，而磷酸盐区域因高胆固醇饱和效应变化不明显，O-H区域差异主要归因于冻干后水合状态差异。DSC分析显示，CR=35%制剂表观干态转变最低点为66.20 °C、焓变1.44 J/g，CR=50%制剂降至64.28 °C、焓变0.62 J/g（降低约57%），表明高胆固醇削弱了干态脂质基质的残余链协同性。
6. 纯化方法与胆固醇比例对粒径和包封效率的影响
采用透析和超滤两种纯化方法，在CR=35%和50%下制备共包封阿伏苯宗（AVO）、奥克立林（OMC）和尼罗红（NR）的脂质体。增加CR从35%至50%降低了两种纯化方法下的粒径和PDI；超滤整体产生略小且更单分散的囊泡，归因于压力驱动的快速处理减少了囊泡形成后的融合/重组。包封效率呈现货物依赖性：三种货物的油水分配系数（LogP）分别为OMC=5.91、AVO=4.48、NR=2.98，高LogP的AVO和OMC表现出更高包封率，AVO在CR=35%下达约94%；NR因LogP较低而包封率较低。增加CR至50%显著降低几乎所有货物的包封效率，高胆固醇过度冷凝双层减少了疏水货物的可用空间。超滤使AVO和OMC的包封率降低，可能与压力/剪切效应引起部分渗漏有关；NR在超滤下呈现更高表观包封效率，可能因NR聚集被截留造成高估。NTA和DLS分析均显示单一的纳米级群体（约90–105 nm范围），跨度值1.2–1.3表明尺寸分布相对均一。TEM观察显示以球形囊泡为主，无盘状双分子层结构，ImageJ定量分析得平均粒径约103±28.7 nm（n=93），与DLS结果一致。NTA测得颗粒浓度5.5–7.8×1012 particles·mL?1，与理论估算值约5.6×1012 particles·mL?1处于同一数量级。ζ-电位保持在?23至?28 mV的中等负值范围内，CR增加使ζ-电位负值增强，归因于胆固醇驱动的膜堆积和界面水合作用改变。
7. 储存稳定性
45天储存后，所有条件下粒径和PDI的相对变化约为3–8%，表明制剂在45天内可视为物理稳定。超滤样品出现粒径减小和PDI改善的趋势，可能与残留乙醇（约2–3%）软化双层并促进缓慢结构弛豫有关；透析则理论上可将乙醇降至<0.01%。
8. 细胞相容性
空白脂质体在100–800 μg·mL?1脂质浓度范围内对HaCaT角质形成细胞和成纤维细胞均保持约90%以上的细胞活力，表明脂质载体本身无明显细胞毒性。AVO/OMC负载脂质体在成纤维细胞中维持约90–100%活力；在角质形成细胞中呈浓度依赖性毒性，400 μg·mL?1时活力降至约70%（ISO 10993-5非细胞毒性阈值），800 μg·mL?1时进一步降至约60%。这种细胞类型依赖性反应可能与负载UV过滤剂的细胞摄取、代谢应激及膜-颗粒相互作用的差异有关。
研究结论
本研究开发了一种温度控制的微流控平台，用于DSPC-PEG化脂质体的可重现合成，解决了高T
m脂质体系加工的关键限制。将脂质相维持在DSPC相变温度以上对于改善脂质体形成、减小粒径和收窄尺寸分布至关重要。系统评价确定了3% mPEG-DSPE和4.5 mg·mL?1脂质浓度为有利于均一可重现脂质体的条件。响应面优化证明FRR、TFR和胆固醇比例交互调控脂质体尺寸和分散性，验证的最优条件为FRR=2、TFR=2 mL·min?1，获得平均粒径约115–120 nm、低PDI的脂质体。ATR-FTIR和DSC分析支持脂质组分掺入并揭示了胆固醇依赖的表观干态热行为变化。包封和纯化研究表明35%胆固醇制剂在结构完整性和疏水货物负载间达到最佳平衡，包封效率高达约94%。超滤实现更快处理并产生略窄的尺寸分布，而透析对某些货物保持更高包封效率。DLS、NTA和TEM独立表征证实了具有窄粒径分布的纳米级囊泡形成，制剂在45天内保持物理稳定。细胞活力结果表明空白脂质体载体对角质形成细胞和成纤维细胞均耐受良好，AVO/OMC负载脂质体在最高剂量下诱导角质形成细胞活力呈浓度依赖性降低，表明对该负载制剂的细胞类型依赖性敏感性。总之，将温度控制与多变量工艺优化相结合能够实现结构经过验证的DSPC脂质体的可靠制造，并具有可调的理化性质，为药物递送和纳米化妆品应用提供了坚实基础。该温度控制微流控平台具有广泛适用性，可通过进一步优化适用于其他脂质制剂、疏水性治疗剂和微流控器件几何构型。
