《Journal of Proteome Research》：ProtPen Combines Sequence- and Structure-based Approaches to Facilitate Protein Function Predictions on a Proteome-wide Scale
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未知功能蛋白构成了对生物过程理解的重大空白，涵盖了许多生物尤其是原核生物蛋白质组中相当大的部分。解决这一空白对于理解此类生物体的生物学与致病性至关重要。研究人员介绍了ProtPen，一个开源流水线，通过结合eggNOG-mapper（基于序列的注释）与Fold
未知功能蛋白构成了对生物过程理解的重大空白，涵盖了许多生物尤其是原核生物蛋白质组中相当大的部分。解决这一空白对于理解此类生物体的生物学与致病性至关重要。研究人员介绍了ProtPen，一个开源流水线，通过结合eggNOG-mapper（基于序列的注释）与Foldseek（利用AlphaFold预测的蛋白质结构进行快速结构相似性搜索）来促进蛋白质功能预测。两种工具的注释结果被合并，并利用UniProt元数据 enrichment，产生适用于下游分析的综合输出。该流水线仅需包含UniProt标识符的FASTA输入文件，并设计用于分析整个蛋白质组规模的数据集。在精心整理的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）特征蛋白数据集上的基准测试表明注释准确率>90%，并凸显了基于序列与基于结构方法的互补性。对ProtPen的进一步评估包括将其应用于生物学相关数据集中表现出显著差异丰度的未知功能蛋白（来自P. aeruginosa蛋白质组学数据集）以及来自死海盐古菌（Haloferax volcanii）的未表征糖蛋白。ProtPen易于扩展以整合额外的蛋白质功能预测工具。总之，该流水线促进了来自蛋白质组学数据集与完整蛋白质组中未知功能蛋白的系统范围注释。
研究背景方面，随着下一代测序（NGS）与宏基因组学的发展，大量基因组被测序，理论蛋白质组中仍存在显著比例的未知功能蛋白，在原核生物中可达30–50%，即便在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ESKAPE病原体组成员）中也有9%未表征，死海盐古菌（Haloferax volcanii）中达29.5%。传统基于序列同源的方法（如BLAST、HMMER、eggNOG-mapper）在远同源或低序列一致性时精度下降；而基于三维结构的方法可捕获非序列保守的功能关系。AlphaFold2推动的结构预测使得Foldseek等工具能大规模比对预测结构。已有MorF、Phold等流程存在可移植性或适用范围限制。为此，研究人员开发ProtPen，一个模块化Python流水线，整合eggNOG-mapper序列注释与Foldseek结构搜索，面向全蛋白质组尺度未知功能蛋白注释。
关键技术方法上，研究人员采用含UniProt ID的FASTA参考蛋白质组作为输入；序列注释用eggNOG-mapper v2.1.12（MMseqs2比对，eggNOG v5数据库，e-value 0.001）；结构侧通过AlphaFoldDB REST API按需获取查询蛋白PDB结构，用Foldseek v9对PDB库做easy-search（e-value 0.001，默认参数）；结果经过滤、Top-N保留、用UniProt/RCSB GraphQL API enrichment（InterPro、SUPFAM域）后，按UniProt ID与eggNOG结果合并为统一TSV。测试队列包括115条铜绿假单胞菌PAO1实验验证蛋白对照集，四个完整参考蛋白质组（P. aeruginosa PAO1、Neisseria gonorrheae FA614、H. volcanii DS2、Pyrococcus furiosus ATCC 43587），以及两个实验数据集：PRIDE库PXD044807（P. aeruginosa不同碳源差异丰度蛋白）与H. volcanii DS2 N-糖蛋白组。
研究结果部分，在“ProtPen整合序列与结构方法的潜在蛋白注释”中，研究人员说明流水线六大阶段及SLURM封装、多进程并行设计，适用于HPC全蛋白质组处理。“通过定义对照数据集评估性能”中，115条P. aeruginosa已知功能蛋白里104条（90.4%）两工具一致匹配已知功能，Foldseek正确注释113条多于eggNOG-mapper的105条，低序列相似度蛋白结构比对优势明显。“分析完整蛋白质组的未表征蛋白”中，四个原核蛋白质组运行时间随蛋白数线性增长（中位5.1 s/蛋白，16核峰值75 GB），P. aeruginosa有9.0%未表征、N. gonorrheae 11.2%、H. volcanii 29.5%、P. furiosus 18.5%；ProtPen对未表征蛋白双工具注释占大头（如P. aeruginosa 502条中59.4%双注释、32.9%仅Foldseek），Foldseek单独贡献率最高。“ProtPen在实验数据集的应用”下，PXD044807中67条已知功能蛋白62条（92.5%）双工具匹配，9条未知功能中3条双工具一致（推测长链脂肪酸转运、LysR转录调控、乙酰辅酶A合成酶相关），3条仅Foldseek有信息；H. volcanii糖蛋白20条已知功能中15条双匹配无冲突，32条未知中3条双一致（肽转运、S层生物发生、含von Willebrand因子域GATase），15条仅Foldseek注释，体现古菌中结构方法补充价值。
讨论与结论翻译：尽管ProtPen结果积极，其性能受eggNOG与AlphaFold类数据库覆盖与质量限制，且真正未知功能蛋白精度无法直评，应视为假设生成框架而非替代实验表征；评估依赖人工定性打分，大规模应用需更自动定量共识（如LLM比对描述符或InterPro2GO映射）。结论上，ProtPen通过合并eggNOG-mapper与Foldseek注释、enrichment UniProt元数据，在P. aeruginosa对照集达>90%准确率，在四个原核蛋白质组与两个实验队列中显著降低未知功能注释缺口，证明序列-结构联合对原核尤其是古菌未表征蛋白的系统注释效用，且流水线模块化可扩展，发表于《Journal of Proteome Research》。
