正常泪液引流系统的神经解剖学：第一篇：组织病理学、免疫组化及电子显微镜特征分析

《Optometry and Vision Science》：Neuroanatomy of the Normal Lacrimal Drainage System: Paper I: Histopathological, Immunohistochemical and Electron Microscopic Characterization

　　目的：研究并绘制泪液引流系统（LDS）的神经解剖结构。方法：对10个泪小管、泪囊及鼻泪管的样本进行了前瞻性研究。这些样本取自新鲜尸体或具有正常泪液引流系统的摘出标本。评估采用组织病理学、免疫组化、双免疫荧光、Western blot以及扫描电子显微镜等技术。所使用的特殊染色剂包括Masson三色染剂、Luxol快蓝和Kulchitsky-Pal染色剂。神经标记物包括β-微管蛋白III（TUJ-1）、蛋白质基因产物9.5、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶、S-100、微管相关蛋白2、囊泡单胺转运体2、多巴胺β-羟化酶、酪氨酸羟化酶、神经丝H以及神经元一氧化氮合酶。根据形态、拓扑组织学特征以及其在组织中的存在程度，对泪液引流系统内的神经结构进行分类。扫描电子显微镜进一步用于明确组织的神经支配情况。结果：泪液引流系统不同解剖区域存在明显的神经拓扑特征。上皮层、上皮下层及表层间质主要由较细的神经支配，而深层间质及筋膜下层则可见粗大的神经束。神经纤维中有髓鞘和无髓鞘两种类型，以有髓鞘者为主。与上游引流结构相比，鼻泪管中的神经血管及腺体周围神经支配的频率和分布显著增加。泪囊的上皮层和上皮下层主要表达微管相关蛋白2和囊泡单胺转运体2，而鼻泪管则表达多巴胺β-羟化酶和酪氨酸羟化酶，这反映出自主神经系统对鼻泪管腺体及血管的影响逐渐增强。对神经解剖结构的拓扑定位分析为了解泪液引流系统的差异性神经支配提供了依据。结论：这是首项专门研究泪液引流系统组织神经支配的课题。对泪液引流系统的神经解剖学分析表明，其各解剖结构拥有丰富多样的神经供应，特定的组织神经支配水平可能反映了复杂的神经调控机制。目前，人们对泪液引流系统的神经支配了解甚少，仅知道有一些主要神经为其提供支配。泪小管、泪囊以及鼻泪管的上部由三叉神经眼支的下斜肌分支支配，该分支又是三叉神经眼支的组成部分。1–4 鼻泪管的下部则由三叉神经上颌支的前上牙槽支支配。1–4 运动功能由面神经对霍纳-杜弗尼肌的支配实现，该肌肉有助于泪液泵送功能。肾上腺素能和胆碱能系统的作用机制尚未明确，不过有一些零散的证据表明它们存在于泪液生理过程中并可能发挥一定作用。5–12 据作者所知，目前文献中尚无针对泪液引流系统神经解剖学的全面多模式研究。因此，本研究通过组织病理学、免疫组化、免疫荧光、Western blot以及扫描电子显微镜技术，分析了泪液引流系统的拓扑组织学特征及神经支配情况。方法：本研究获得了L.V. Prasad眼科研究所的机构审查委员会和伦理委员会批准，研究过程遵循《赫尔辛基宣言》要求。在获取正常的泪液引流系统样本后，要么用10%中性缓冲福尔马林进行保存（用于组织病理学检测、特殊染色及免疫组化），要么用戊二醛进行保存（用于电子显微镜观察），或者置于-80°下保持新鲜状态（用于蛋白质定量检测及某些特殊染色，如Kpal染色）。石蜡包埋的组织块用德国韦茨拉尔的Leica切片机切成4μm厚的切片，随后进行苏木精-伊红染色、特殊染色（Masson三色染剂、Luxol快蓝及Kulchitsky-Pal染色剂）以及免疫组化检测（蛋白质基因产物[PGP 9.5]、β-III微管蛋白或TUJ-1、神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2、囊泡单胺转运体2、神经丝重链、胶质纤维酸性蛋白、多巴胺β-羟化酶、Doublecortin、神经元一氧化氮合酶、S-100、酪氨酸羟化酶、囊泡乙酰胆碱转运体，以及按制造商建议使用的二级抗体）（见表1）。表1列出了这些抗体的功能与用途。我们选用多种抗体来证实特定神经的存在。表1 神经解剖学定位研究中所用抗体的详细信息抗体稀释度用途目录编号PGP9.5（蛋白质基因产物9.5）1:400通用神经标记物GTX109637（GeneTex）TUJ-1（β-III微管蛋白）1:500特异性识别神经元GTX130245（GeneTex）NSE（神经元特异性烯醇化酶）1:200特异性识别神经元IS612（Dako）MAP2（微管相关蛋白2）1:100可靠的躯体树突标记物NB110-92711（NovusBio）VMAT2（囊泡单胺转运体2）1:200特异性识别单胺能神经元NB110-68123（NovusBio）NFH（神经丝重链）1:200特异性识别神经元细胞骨架及轴突结构NB500-416（NovusBio）GFAP（胶质纤维酸性蛋白）1:400特异性识别非髓鞘施万细胞以及其他胶质细胞NBP13-05198（NovusBio）DBH（多巴胺β-羟化酶）1:200特异性识别去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经元NBP1-31386（NovusBio）Doublecortin（DCX）1:200特异性识别未成熟及发育中的神经元NBP1-72042（NovusBio）nNOS（神经元一氧化氮合酶）1:200识别神经元及血管内皮细胞、树突NBP1-39681（NovusBio）S-1001:1000专门用于识别施万细胞NBP2-45267（NovusBio）酪氨酸羟化酶（TH）1:200特异性识别儿茶酚胺能神经元GTX113016（GeneTex）VAChT（囊泡乙酰胆碱转运体）1:200特异性识别胆碱能神经元NB110-74764（NovusBio）二级抗体按试剂盒说明及制造商建议使用NBP1-72764（NovusBio）免疫组化表1列出了用于泪液引流系统免疫组化分析的一级抗体、其来源、克隆类型以及稀释比例。首先用二甲苯对所有4μm厚的石蜡切片进行脱蜡处理，然后依次用浓度为100%、90%和80%的乙醇进行复水。之后用含3%过氧化氢的甲醇（印度孟买Fine-chem Limited公司生产；印度孟买Thermo Fisher Scientific公司生产）处理20分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次。接着用pH值为9.0的EDTA缓冲液加热切片30分钟，进行抗原提取。抗原提取后的切片用牛血清白蛋白（美国密苏里州Sigma-Aldrich公司生产）处理20分钟，以防止非特异性抗体结合。之后用一级抗体（美国科罗拉多州Novus Biologicals公司、加利福尼亚州GeneTex公司以及丹麦格洛斯特鲁普DAKO公司生产）处理，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再加入二级抗体孵育30分钟。随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，再用DAB显色剂（美国加利福尼亚州BioGenex公司生产）处理5分钟，用蒸馏水冲洗，最后用Harris苏木精进行复染。最后用DPX封片剂（印度孟买Fine-chem Limited公司生产）将切片封在盖玻片下。双免疫荧光这种技术可用于在同一样本中同时显示两种不同的抗原，通常用于细胞或组织样本。操作步骤包括脱蜡、复水，以及在pH值为6–6.2的柠檬酸钠缓冲液中进行抗原提取。随后将组织切片在2.5%的BSA中封闭1小时，然后在4℃下与一级抗体S100孵育过夜。之后将组织样本在室温下与二级抗体孵育2小时。在4℃下加入(PGP9.5)抗体（美国科罗拉多州Novus Biologicals公司生产）并孵育过夜，然后再加入二级抗体孵育2小时，最后用盖玻片封片以便观察。一级抗体通过Alexa Fluor 488/594色的二级抗体进行检测，细胞核则用DAPI进行复染。为验证一级抗体的特异性，还设置了阴性对照，即不加入一级抗体的组织切片。Western Blot采用BCA法测定蛋白质浓度。将40μg的蛋白质加载到凝胶上，在100V电压下通过SDS-PAGE电泳分离。蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭1小时。接着加入特定的一级抗体，在4℃下孵育过夜。用TBS洗涤膜3次，每次10分钟，然后加入二级抗体，在摇床上孵育1小时，之后再用TBS洗涤3次。扫描电子显微镜首先用磷酸盐缓冲液清洗样本，然后用2.5%的戊二醛（印度塞康德拉巴德的Himedia公司生产）固定，再次清洗后，逐步用不同浓度的乙醇（10%、25%、50%、70%、90%和100%，每种浓度下处理20分钟）进行脱水处理，最后在空气中过夜风干。使用高真空蒸发仪（英国苏塞克斯郡Quorum Technologies公司的SC7620溅射镀膜机）将样品表面镀上金钯合金，镀膜时间为60秒，最后用德国耶拿的Carl Zeiss公司生产的Zeiss EVO 18型扫描电子显微镜观察样品。扫描电子显微镜的图像采集电压范围为5到20千伏。在不同放大倍率下获得的周围神经图像会被进一步分析。成像与量化最初使用奥林巴斯显微镜（日本东京奥林巴斯公司生产的BX51型号）对标本进行观察。所谓“热点”是指通过常规染色、特殊染色或免疫组化标记能够识别出神经束和神经纤维的区域。这项识别工作由经验丰富的眼科病理学家D.K.M.统一完成。在确定热点位置后，会对神经纤维进行定性分析。分析过程中借助软件（美国Leica Bioimaging systems公司的Leica Aperio-AT2系统）将整个组织样本中的所有神经纤维标记为粗神经纤维和细神经纤维，同时在相同放大倍率下识别出整个样本中的所有神经束。根据10个观察区域中每组染色纤维的平均总数，实时统计神经束的数量。若神经束仅含一个细胞核或厚度小于5微米，则被定义为细神经束或碎片状神经束；而如果神经束含有多个细胞核且厚度等于或大于5微米，则被定义为粗神经束。通过上述各种技术，研究了组织层面神经束的位置及其特征。结果表2详细展示了泪液引流系统神经支配的拓扑分布情况。以下将按照不同解剖区域的特点对研究结果进行阐述。表2 泪液引流系统的区域神经支配解剖区域上皮层表层间质深层间质筋膜下层1. 泪小管细NF+细NF++VN+粗NF++VN+偶尔在边缘出现FN+2. 泪囊底部细NF+MAP2+VMAT2+细NF+VN+NSE+、NFH+、GFAP+腺体周围神经+++粗NF++有髓神经++无髓神经+VN+NSE+、NFH+、GFAP+、nNOS+、DBH+、S-100+粗NF和细NF+++有髓神经++、无髓神经+VN++NSE+、NFH+、GFAP+、nNOS+、DBH+、S-100+3. 泪囊主体细NF+ MAP2+VMAT2+DBH+、TH+细NF+VN++NSE+、NFH+、GFAP+腺体周围神经++有髓神经+粗NF+++VN+++nNOS+、DBH+、S-100+、NSE+、NFH+、GFAP+腺体周围神经+有髓神经++粗NF和细NF++有髓神经++、无髓神经+VN+++NSE+、NFH+、GFAP+、nNOS+、DBH+、S-100+4. 鼻泪管（NLD）DBH++、TH++VN++有髓神经++腺体周围+++DBH++、TH++无髓神经+有髓神经+++腺体周围+++ DBH++、TH++有髓神经++粗NF+++有髓神经+++有髓神经++有髓；NF，神经纤维；无髓，无髓神经；VN，神经血管。泪小管组织病理学检查显示，泪小管壁存在密集的神经支配（图1A–I）。上皮下区域可见细神经纤维，而表层间质和深层间质则存在多条粗大的神经束。还观察到了局部神经血管（包含静脉和动脉）。偶尔会有1到2个区域出现碎片状神经。这些发现通过免疫组化和双免疫荧光技术得到了进一步验证（图1G、I）。打开多媒体模式图1. 泪小管的神经支配：显微照片显示泪小管腔，腔内衬有复层鳞状上皮。（H&E染色，5倍数字扫描，A）显微照片显示表层间质中的神经束（箭头）（H&E染色，20倍数字扫描，B）、深层间质中的粗神经（箭头）及神经血管（菱形符号）（H&E染色，20倍数字扫描，C），以及泪小管壁上的完整神经（星号标记）（H&E染色，20倍数字扫描，D）。免疫组化显微照片显示上皮下区域的细神经（星号标记）（TUJ-1抗体，40倍数字扫描，E），以及深层间质中的粗神经（箭头）（TUJ-1抗体，40倍数字扫描，F）。免疫荧光显微照片显示TUJ-1抗体和DAPI抗体的阳性对照（脑组织）的合并图像（40倍数字扫描，G），以及泪小管壁在低倍放大（DAPI和TUJ-1抗体合并图像，20倍放大，H）和高倍放大（DAPI和TUJ-1抗体合并图像，40倍放大，I）下的广泛神经支配情况，表现为红色荧光，由粗细不同的神经束构成。H&E染色，即苏木精-伊红染色。泪囊由于存在易于识别的筋膜下层神经支配以及更清晰的髓鞘特征，其拓扑分布与泪小管有所不同（图2A–I、3A–I和4A–E）。从拓扑结构上看，筋膜下层存在多条粗细不一的神经纤维。深层间质主要呈现粗大的神经束，而上皮下层和表层间质则主要由细神经支配。神经血管在筋膜下层和深层间质中更为丰富，也更容易被观察到（图2B和F）。泪囊的底部和主体的神经支配分布也存在差异，底部的筋膜下层及腺体周围区域有更粗大的神经束，而主体的深层间质则有更粗大的神经束，且神经血管数量显著更多。打开多媒体模式图2. 泪囊的神经支配：显微照片显示泪囊腔（箭头）、衬里上皮（星号标记）以及间质。（H&E染色，3倍数字扫描，A）显微照片显示表层间质中的衬里上皮（星号标记）、粗神经（圆圈标记）及神经血管（矩形符号）（H&E染色，40倍数字扫描，B）；深层间质中的粗神经（圆圈标记）（H&E染色，40倍数字扫描，C）；筋膜下层中的粗神经（圆圈标记）和细神经（带缺口箭头标记）（H&E染色，40倍数字扫描，D）。特殊染色光镜图像显示，厚大的神经束具有神经外膜（黄色箭头头）、神经束膜（小箭头），以及施万细胞的细长波浪形细胞核（Masson三色染法，40倍放大，E），此外还有邻近血管的神经血管（带圆角的矩形）（Masson三色染法，40倍放大，F）。特殊染色微镜图像显示有髓纤维呈现淡蓝色染色（插图中的黑色方块）（Luxol快蓝染法，40倍放大，G），以及筋膜下厚大神经中的有髓纤维（圆形标记）（Kulchitsky-Pal或Kpal染法，40倍放大，H）。免疫组化光镜图像显示厚大的神经纤维（PGP9.5抗体，40倍放大，I）。DS表示数字扫描仪；H&E为苏木精-伊红染色法。点击可查看多媒体内容。图3。点击可查看多媒体内容。

泪囊的神经支配：免疫组化光镜图像显示深部基质中的粗大神经（箭头标记）、细小神经及神经血管（TUJ-1抗体，40倍放大，A）；深部基质中的粗大神经束（箭头标记）和细小神经束（圆形标记）（NSE抗体，40倍放大，B）；朝向管腔的上皮细胞顶端染色（带缺口的箭头标记）（MAP2抗体，40倍放大，C）；上皮细胞的阳性反应（方形标记）（VMAT2抗体，40倍放大，D）；深部基质中的粗大神经纤维（方形标记）和细小神经纤维（箭头标记）（NFH抗体，40倍放大，E）；以及深部基质中的粗大神经纤维（箭头标记）和细小神经纤维（圆形标记）（GFAP抗体，40倍放大，F）。免疫组化微镜图像显示腺体周围区域（箭头标记）及深部基质中的神经血管（弯箭头标记）存在阳性反应（DBH抗体，20倍放大，G）。虽然未检测到双皮质素（DC抗体，6.1倍放大，H）的表达，但深部基质中的粗大神经纤维（椭圆形标记）对神经元一氧化氮合酶（nNOS抗体，40倍放大，I）呈阳性反应。DBH为多巴胺β-羟化酶；DS为数字扫描仪；GFAP为胶质纤维酸性蛋白；MAP2为微管相关蛋白；NFH为多巴胺β-羟化酶；NSE为神经元特异性烯醇化酶；VMAT2为囊泡单胺转运体。点击可查看多媒体内容。图4。点击可查看多媒体内容。

泪囊的神经支配：双重免疫荧光微镜图像显示，表层基质的细小神经纤维中PGP9.5抗体和S100抗体均呈强阳性反应（PGP9.5抗体，20倍放大，A；S100抗体，20倍放大，B），而深层基质中的粗大神经束则同样呈现强阳性反应（PGP9.5抗体，40倍放大，C；S100抗体，40倍放大，D）。新鲜泪囊组织的Western blot检测显示UCH-L1/PGP9.5抗体呈阳性反应（GTX109637抗体，稀释比例为1:1000）。PGP9.5蛋白的分子量约为27千道尔顿（PGP9.5抗体对应的Western blot图像，E）。DS为数字扫描仪。Masson三色染法有助于更清晰地观察深部基质中粗大神经束的神经外膜、神经束膜、施万细胞以及神经血管（图2E和F）。通过Luxol Fast染法和Kulchitsky-Pal染法也可识别出有髓神经纤维（图2G和H）。上皮细胞（主要位于顶端区域）对微管相关蛋白2和囊泡单胺转运体2呈阳性反应，这可能反映了细微的树突状神经纤维以及神经递质的调控作用（图3C和D）。基质中的粗大神经纤维和细小神经纤维均表现出较高的神经元特异性烯醇化酶、神经丝H蛋白以及胶质纤维酸性蛋白的表达水平（图3B、E和F），这体现了神经递质传递的功能，以及成熟和未髓鞘化的神经丝的存在。不过，仅有深层基质中的神经纤维对神经元一氧化氮合酶呈额外阳性反应（图3I），这提示自主神经系统可能对该区域的血液流动产生影响。多巴胺β-羟化酶在神经血管及腺体周围区域呈强阳性反应，反映出交感神经系统对腺体及血管的调控作用（图3G）。值得注意的是，所有样本中均未检测到双皮质素，这说明不存在未成熟的神经组织或神经前体细胞（图3H）。双重免疫荧光检测显示，粗大神经纤维和细小神经纤维中PGP9.5抗体和S100抗体均有良好的表达且定位准确（图4A–D），这表明存在施万细胞，可能还存在更多类型的带髓鞘神经纤维。Western blot检测进一步证实了主要的神经标志物PGP9.5（图4E）和TUJ-1的存在。

鼻泪管：组织病理学检查显示，从泪囊到鼻泪管的筋膜下及深层神经支配逐渐增强（图5A–I）。筋膜下的神经支配主要由明显更粗大的神经束构成。与泪点相比，此处神经血管及腺体周围神经支配更为丰富。双重免疫荧光检测进一步验证了这些发现，同时还显示出上皮细胞、腺体周围区域及神经血管中多巴胺β-羟化酶和酪氨酸羟化酶呈强阳性反应，这说明与泪点相比，鼻泪管的结构性成分受到更强的自主神经系统调控（图5G、I）。点击可查看多媒体内容。图5。点击可查看多媒体内容。

鼻泪管的神经支配：光镜图像展示了鼻泪管的组织病理结构。可见明显的海绵状血管（H&E染色法，0.5倍放大，A），筋膜下的粗大神经（TN）及神经血管（VN）（H&E染色法，40倍放大，B），以及基质中的粗大神经束（五边形标记）（H&E染色法，40倍放大，C）。免疫组化微镜图像显示筋膜下有粗大神经（三角形标记）和细小神经（TUJ-1抗体，20倍放大，D），深部基质中有粗大神经束（三角形标记）（TUJ-1抗体，40倍放大，E），还有粗大神经纤维（带缺口的箭头标记）、细小神经纤维（圆形标记）以及神经血管（S-100抗体，40倍放大，F）。双重免疫荧光微镜图像显示粗大神经纤维呈红色免疫荧光反应（DAPI和TUJ-1抗体共同作用的结果，40倍放大，G），上皮细胞及上皮下细胞中DBH抗体和TH抗体也呈强阳性反应（DAPI和DBH抗体共同作用的结果，10倍放大，H；DAPI和DBH抗体共同作用的结果，10倍放大，I）。DBH为多巴胺β-羟化酶；DS为数字扫描仪；H&E为苏木精-伊红染色法；TH为酪氨酸羟化酶。

电子显微镜观察：对泪点和鼻泪管的连续横切面进行超微结构观察后获得了有趣的结果（图6A–D）。神经束与血管伴行，神经分支出现的区域与血管分支区域一致（图6B和C）。电子显微镜观察进一步证实了不同区域存在粗大神经束和细小神经束的现象。

扫描电子显微镜观察：扫描电子显微镜图像显示了带有管腔的泪囊结构。可见横切面图像（扫描电子显微镜，43倍放大，A）。高倍率扫描电子显微镜图像显示神经束及其分支结构、郎飞结以及施万细胞的结节状突起（扫描电子显微镜，6890倍放大，B）。神经束的横切面图像显示其表面覆盖有神经束膜，还有施万细胞的结节状突起（扫描电子显微镜，2000倍放大，C），在高倍率下还可观察到多个神经分支结构（扫描电子显微镜，7000倍放大，D）。

整体神经支配分布：为总结整体研究结果，作者们绘制了示意图，展示了按解剖区域划分的神经支配情况（图7A–D）。这些示意图分别展示了从上皮层到筋膜下区域的神经支配情况，包括粗大神经束、细小神经束、神经血管以及腺体周围的神经支配。

图7。点击可查看多媒体内容。

泪囊神经解剖结构的拓扑图示：基于组织病理学、免疫组化、免疫荧光及电子显微镜检查结果绘制的标注示意图，展示了泪小管的横切面（A）、泪囊底部（B）、泪囊主体（C）以及鼻泪管（D）的结构。图中每个区域都被划分为上皮层、基质层和筋膜下层。不同区域内粗大神经纤维、细小神经纤维（黄色标记）以及神经血管（带黄色阴影的红色椭圆形结构以及带黄色阴影的蓝色结构）的分布情况也一目了然。

讨论：本研究首次采用多种检测方法系统探讨了泪道系统的神经解剖结构。神经解剖学分析表明，泪道系统的各种解剖结构都拥有丰富多样的神经支配，其组织层面的神经支配特征也反映出泪道系统可能存在复杂的神经调控机制。历史上，最早对泪道系统神经支配进行明确描述的是鲁道夫·罗伯特·迈尔（1824–1888），他认为泪道的神经支配来自眶下神经、筛神经以及上颌前牙神经的分支。早期关于泪小管周围Horner-Duverney肌的研究也发现了肾上腺素能、胆碱能以及感觉神经末梢的存在，这表明泪小管的功能可能受到复杂的神经调控，同时也影响着泪小管系统的功能。本研究直接检测了泪小管壁的神经支配情况，发现其不同结构组成部分的神经支配存在差异。本研究的一个有趣发现是，神经元的分支模式与伴随的血管分支模式相似。关于这种神经分支模式的历史记载也很有趣。塞缪尔·莫里茨·帕彭海姆在1842年发表了经典著作《眼睛的特定组织学：结合发育史与眼科临床实践》，他在书中提到了泪点及鼻泪管壁内的特殊分支模式（帕彭海姆将其称为鼻通道）：“在其外表面，骨膜内侧，血管深入组织内部，其主干与泪囊的纵向方向一致。用醋酸处理后可见的神经也沿着相同的方向延伸。血管和神经还会在鼻通道的外壁上呈横向分布。”法诺·萨尔瓦多在1865年发表的著作《关于泪囊卡他病的研究报告》中也观察到了泪点及鼻泪管周围腺体区域的类似分支模式。他指出：“这里的神经非常丰富，与最大的毛细血管伴行，且像毛细血管一样依次分叉。”本研究还分析了施万细胞及髓鞘的存在情况，发现虽然许多神经纤维都有髓鞘，但在泪点及鼻泪管的上皮层和上皮下层仍存在部分无髓鞘神经纤维。早期很少有研究探讨自主神经系统对泪液引流管径及功能的影晌，也没有研究关注神经功能紊乱是否会导致原发性获得性鼻泪管阻塞。在本研究中，可在基质层及筋膜下层清晰观察到神经血管，同时泪点及鼻泪管的上皮层、基质层和筋膜下层也存在肾上腺素能及胆碱能神经元，这表明自主神经系统对泪液引流功能有着重要影响。此外，泪点上皮层中存在胆碱能刷状细胞，这也说明泪道系统存在内在的胆碱能调节机制，以及复杂的自主神经调控功能。本研究也存在一些局限性，比如样本量较小，尸体组织及摘除组织的差异较大，缺乏功能相关性数据，且描述主要以定性为主。不过，该研究的优势在于首次对泪液引流系统的神经解剖结构进行了系统研究，并采用了多种检测方法进行分析。总体而言，本研究明确了泪道系统的组织神经支配情况。对其神经解剖学的分析表明，泪道系统的各种解剖结构都拥有丰富多样的神经支配，其组织层面的神经支配特征也反映出该系统可能存在复杂的神经调控机制。这为了解泪道系统复杂的神经解剖结构及其在泪液引流和调控中的作用提供了基础。未来还需要进一步研究神经支配随年龄的变化规律，以及神经功能紊乱与泪液引流障碍之间的关系。

致谢：作者感谢Nandini Bothra博士和Raoul D Henson博士在博士研究期间给予的宝贵建议。