外侧隔区GABA能神经元中GLUT4质膜转位支持神经元激活和社会熟悉性

《Cell Reports》：GLUT4 plasma translocation in lateral septum GABAergic neurons supports neuronal activation and social familiarity

　　

社会互动调节神经元兴奋性和行为，外侧隔区（LS）在社会行为中发挥重要作用。然而，支持LS依赖性社会反应的分子机制仍不清楚。在这里，研究人员发现神经元活动驱动的葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）在LS GABA能神经元中的质膜转位支持社会熟悉性。神经元激活触发钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα（CaMKIIα）介导的GLUT4在Ser²⁴³和Ser²⁵⁴位点的磷酸化，这增强了Rab10结合、GLUT4表面插入和葡萄糖摄取。一种细胞通透性TAT-GLUT4(2D)肽破坏GLUT4-Rab10结合，阻断活性依赖性GLUT4转位，并损害社会熟悉性。LS GLUT4敲低破坏社会新颖偏好，这种缺陷可由野生型GLUT4挽救，但不能由运输缺陷或运输缺陷突变体挽救。在5xFAD小鼠中，GLUT4质膜转位在社会新颖偏好期间减少。在LS GABA能神经元中选择性表达质膜定位的GLUT4可恢复神经元激活和社会熟悉性缺陷，表明GLUT4运输是阿尔茨海默病相关社会缺陷的潜在靶点。

本研究从葡萄糖代谢与神经元活动的耦联机制出发，探讨了外侧隔区（LS）GABA能神经元中活动依赖性GLUT4质膜转位在社会熟悉性中的作用。已有研究表明，LS是调控社会行为的关键脑区，整合来自皮层和皮层下的输入并投射至下游区域，但其支持社会反应的分子机制尚不明确。GLUT4在脑区如LS、海马和小脑中表达，且已知海马GLUT4在记忆训练后转位至质膜，但神经元活动诱导GLUT4质膜转位的详细分子机制及其体内功能意义一直未知。阿尔茨海默病（AD）患者常表现出社会认知缺陷，包括熟悉个体识别障碍，且脑葡萄糖代谢降低与认知下降相关，但LS中GLUT4转位是否参与AD社会缺陷尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明LS GABA能神经元中GLUT4活动依赖性转位的分子机制及其对社会熟悉性的功能意义，并探索其在AD模型中的治疗潜力。该研究发表于《Cell Reports》。

研究人员采用了一系列关键技术方法：利用体外活性依赖性GLUT4质膜转位实验（包括KCl去极化刺激PC12细胞和原代神经元）结合表面荧光比率测定；通过体内质膜蛋白提取（水相两相分离法）和2-脱氧葡萄糖（2-DG）摄取实验检测LS组织中的葡萄糖摄取；运用结构域置换策略构建GLUT4/GLUT1嵌合体以鉴定关键转位结构域；采用免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down联合质谱分析筛选上游激酶和相互作用蛋白；通过病毒介导的shRNA敲低和VGAT1-Cre依赖性拯救实验在LS GABA能神经元中特异性操纵GLUT4；利用细胞通透性TAT-2D肽干扰GLUT4-Rab10结合；并在5xFAD小鼠模型（6月龄，来自徐州医科大学）中过表达组成型活性GLUT4-2D突变体进行行为学干预。行为学检测包括三箱社交测试和社会习惯化-去习惯化测试。

研究结果主要分为以下几个部分：

**Social novelty preference drives GLUT4 plasma translocation in LS**：通过免疫荧光和qPCR分析，发现GLUT4主要表达于LS GABA能神经元。在VGAT-Cre:Ai14小鼠中，社会新颖偏好训练后，LS GABA能神经元中c-Fos表达增加，而社会互动阶段未见变化。水相两相分离实验显示，社会新颖偏好后LS质膜GLUT4水平显著升高，而社会互动阶段无变化。2-DG摄取实验表明，社会新颖偏好期间LS中葡萄糖摄取特异性增加。这些结果表明，社会新颖偏好驱动LS中GLUT4质膜转位和葡萄糖摄取。

**235–271 aa of GLUT4 is necessary and sufficient for its activity-dependent plasma membrane insertion**：通过构建FLAG-GLUT4-GFP报告系统，在KCl刺激的PC12细胞和原代神经元中，发现GLUT4发生活动依赖性转位而不改变总蛋白或mRNA水平。利用GLUT4/GLUT1嵌合体置换策略，确定GLUT4的235-271氨基酸区域是KCl诱导表面插入所必需且充分的。

**Phosphorylation of GLUT4 at Ser243 and Ser254 sites regulates its activity-dependent plasma insertion**：免疫沉淀结合磷酸化抗体检测显示，KCl刺激诱导GLUT4丝氨酸磷酸化增加。序列比对发现Ser²⁴³、Thr²⁴⁸和Ser²⁵⁴高度保守。将Ser²⁴³或Ser²⁵⁴突变为非磷酸化丙氨酸（2A）消除了KCl诱导的转位，而双位点磷酸模拟突变（2D）在无刺激下即驱动表面插入。Thr²⁴⁸突变无影响，表明Ser²⁴³和Ser²⁵⁴的双重磷酸化是转位所必需的。

**CaMKIIα phosphorylates GLUT4 and promotes its insertion into the plasma membrane**：GST pull-down联合质谱分析从LS组织（社会新颖偏好后）中鉴定出CaMKIIα为候选激酶。Co-IP证实GLUT4与CaMKIIα（而非CaMKIIγ）相互作用，且社会新颖偏好增强其结合。体外激酶实验表明CaMKIIα直接磷酸化GST-GLUT4(235-271)片段，但2S/2A突变体不被磷酸化。在PC12细胞中，CaMKII抑制剂KN93（而非PI3K抑制剂LY294002）阻断KCl诱导的GLUT4磷酸化和表面插入，表明该过程由CaMKIIα介导且独立于胰岛素-PI3K信号。

**CaMKIIα phosphorylation of GLUT4 enhances its interaction with Rab10 and promotes GLUT4 surface insertion**：Co-IP显示社会新颖偏好后GLUT4-Rab10结合增强，且KN93抑制该结合，而GLUT4-2D磷酸模拟突变增强结合。体外GST pull-down证实磷酸模拟GLUT4肽段与Rab10直接结合更强。为干扰该结合，研究人员设计了细胞通透性TAT-2D肽（含GLUT4 235-271磷酸模拟序列）。TAT-2D可减少KCl诱导的GLUT4-Rab10相互作用和表面插入，而不影响GLUT4磷酸化本身。

**TAT-GLUT4 (2D) interference with GLUT4 plasma translocation in LS impairs social familiarity**：在LS双侧注射生物素标记的TAT-2D肽后进行社会新颖偏好测试。TAT-2D处理小鼠的社会新颖偏好受损，而社会互动和总探索时间不受影响。社会习惯化-去习惯化测试表明，TAT-2D小鼠无法对熟悉鼠产生习惯化（维持高探索水平），但对新鼠的去习惯化正常，提示熟悉个体识别缺陷。随后的生化分析显示，TAT-2D降低了LS中GLUT4-Rab10相互作用、质膜GLUT4水平、葡萄糖摄取以及AMPK-CRTC2信号通路激活（AMPK和CRTC2去磷酸化、ERK磷酸化、CRTC2核转位），并减少c-Fos表达。这表明GLUT4转位抑制导致LS神经元激活降低和社会熟悉性损害。

**Activity-dependent GLUT4 plasma translocation and glucose uptake in LS GABAergic neurons are indispensable for social novelty preference**：利用VGAT1-Cre系统在LS GABA能神经元中特异性敲低GLUT4（shGLUT4），并共表达shRNA抵抗的野生型GLUT4（WT）、转位缺陷型2A突变体或葡萄糖转运缺陷型E345Q突变体。行为学检测显示，GLUT4敲低导致社会新颖偏好缺陷，仅WT完全挽救，2A和E345Q均无效。生化分析表明，社会新颖偏好后，WT和E345Q（但非2A）发生质膜转位；敲低组AMPK-CRTC2信号和葡萄糖摄取受损，仅WT恢复。c-Fos表达也仅被WT挽救。这些结果证明，在LS GABA能神经元中，GLUT4的活动依赖性转位和葡萄糖转运能力对于社会新颖偏好均不可或缺。

**Overexpression of GLUT4-2D in LS GABAergic neurons rescued the impaired social familiarity in AD mice**：在5xFAD小鼠（6月龄）中，社会新颖偏好能力受损，但社会互动正常。与WT相比，5xFAD小鼠在社会新颖偏好后LS中c-Fos表达不增加，GLUT4质膜转位减弱。在LS GABA能神经元中过表达组成型表面定位的GLUT4-2D（而非2A或mCherry对照），可恢复社会新颖偏好后的c-Fos表达和质膜GLUT4水平，并显著改善社会新颖偏好和社会习惯化缺陷。这表明促进GLUT4质膜转位可挽救AD小鼠的社会熟悉性障碍。

总结讨论部分，本研究揭示了LS GABA能神经元中一条CaMKIIα-GLUT4-Rab10通路，将神经元活动与葡萄糖摄取和社会熟悉性偶联。该机制独立于经典的胰岛素-PI3K信号通路，并且GLUT4的235-271区域及Ser²⁴³/Ser²⁵⁴磷酸化是神经元特异性活动依赖性转位的关键。在5xFAD小鼠中，该转位过程受损，而通过表达组成型活性GLUT4-2D可恢复神经元激活和社会熟悉性，提示GLUT4运输可能是AD相关社会缺陷的潜在治疗靶点。研究结论翻译如下：总之，本研究揭示了一条CaMKIIα-GLUT4-Rab10通路，该通路将神经元活动与葡萄糖摄取和LS依赖性社会熟悉性偶联，并提示GLUT4运输是AD相关社会缺陷的潜在靶点。