《Cell Reports Methods》：A sensitive method for profiling cell-type-specific secretomes of rare cells from complex tissues
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基于邻近连接（proximity-ligation）的方法已使特定细胞类型分泌组的研究成为可能，然而这类方法依赖病毒载体将生物素连接酶递送至靶细胞，可能诱发先天免疫反应并限制其在难转导细胞类型中的应用。研究人员旨在构建一种在cre-loxP重组系统控制下表达生
基于邻近连接（proximity-ligation）的方法已使特定细胞类型分泌组的研究成为可能，然而这类方法依赖病毒载体将生物素连接酶递送至靶细胞，可能诱发先天免疫反应并限制其在难转导细胞类型中的应用。研究人员旨在构建一种在cre-loxP重组系统控制下表达生物素连接酶的小鼠品系，与细胞类型特异性驱动系杂交后，生物素连接酶在靶细胞内质网（ER）中表达。作为概念验证，研究人员对完整肝脏与培养气道中具先天免疫功能的稀有细胞分泌组进行了分析。该方法具备显著灵敏度，可捕获单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱中未检出的细胞特异性蛋白。研究人员已将这一遗传分泌组小鼠模型向学界开放，以支持体外与体内任意给定细胞类型的细胞间通讯、分泌蛋白功能及生物标志物发现研究。
研究背景方面，基于邻近标记（proximity-based labeling）的蛋白标记技术推动了靶细胞分泌蛋白组（secretome）的非偏倚鉴定，但既有方法多采用病毒载体递送定位于内质网（ER）的泛素连接酶（如BirA*、TurboID），存在转导效率差异、血清型依赖、启动子不确定性及病毒诱导先天免疫应答等局限，且对占比极低却具重要生理功能的稀有细胞（如肝库普弗细胞、气道微褶（M）细胞）分泌组检测灵敏度不足。为此，研究人员构建了LSL-ERTurboID小鼠品系，将ERTurboID（内质网定位TurboID，采用Igκ信号肽与RDEL滞留信号）插入H11安全港位点，由pCAG启动子驱动，前置loxP-STOP-loxP（LSL）终止盒，经CreER介导重组后表达，避免了病毒载体使用。
关键技术方法上，研究人员利用LSL-ERTurboID小鼠分别与Trp63-CreER、Clec4f-Cre、Sox8-CreER等细胞类型特异性驱动系杂交，在体外（气道基底干细胞、气液界面（ALI）培养）与体内（完整肝脏）场景中，以4-羟基他莫昔芬（4OHT）诱导重组，外源生物素孵育后，通过链霉亲和素pull-down富集生物素化分泌蛋白，结合质谱（mass spectrometry）鉴定；样本队列来源于小鼠气管基底干细胞培养、Clec4f-Cre杂交小鼠肝脏、Sox8-CreER杂交小鼠ALI分化气道上皮（RANKL诱导M细胞），并以肝细胞病毒递送ERTurboID及分泌抑制剂（Brefeldin A、Monensin）作对照。
研究结果部分，“开发用于细胞类型特异性分泌蛋白分析的小鼠模型”小节中，研究人员通过Trp63-CreER×LSL-ERTurboID气管基底干细胞验证：4OHT诱导后免疫印迹检得40.6 kDa HA-ERTurboID条带，流式显示77%细胞表达，条件培养基链霉亲和素印迹证实分泌蛋白生物素化高效特异，且RDEL变异较KDEL更有效降低非特异标记。“利用LSL-ERTurboID小鼠模型研究体内低丰度细胞分泌组”小节中，Clec4f-Cre×LSL-ERTurboID小鼠肝脏库普弗细胞（占肝体积<5%）分泌组经基因集富集分析（GSEA）显示CLEC4F、MRC1、CD5L、C1QB等巨噬细胞标志物富集，通路分析揭示经典补体激活、他汀途径、凝血级联等组织驻留巨噬细胞相关通路，证明模型在体内稀有细胞具高特异灵敏。“定义稀有肺细胞类型气道M细胞分泌组”小节中，Sox8-CreER×LSL-ERTurboID ALI培养经RANKL诱导M细胞（约5%比例），分区收集基底侧与腔面分泌组，两重复高度相关（基底侧>98%、腔面>95%共享命中），共鉴定108个M细胞特异性分泌蛋白（基底侧105、腔面37），94/105与34/37具UniProt分泌注释，29个蛋白未在既往scRNA-seq（58个M细胞）中出现；功能分类涵盖抗菌（调理素、铁螯合）、细胞外基质、蛋白酶抑制、CCL20、IL4I1、CGRPβ、TNFRSF11B（骨保护素）、PIGR、FcαμR、VCAM1、ICAM1、GLYCAM1及MHC I/II，其中FcαμR、GLYCAM1为转录组未覆盖的新发现。
讨论部分总结：研究人员提出LSL-ERTurboID遗传模型实现了体外与体内细胞类型特异性分泌组的高灵敏、高特异鉴定，克服病毒载体缺陷；在气道M细胞中新发现FcαμR（分泌型IgA受体）、GLYCAM1及胞外囊泡MHC II提示M细胞可能经囊泡介导抗原传递至免疫细胞，补充了肠M细胞摄取SIgA已知机制。该模型为稀有细胞分泌蛋白功能、细胞通讯与生物标志物发现提供通用平台。
研究结论翻译：研究人员报道了一种用于体内外兴趣细胞类型分泌蛋白组从头鉴定的方法，其灵敏度与特异性突出。尽管气道培养中M细胞仅占5%，仍回收大量命中，包括转录组数据低覆盖甚至缺失的低丰度蛋白。气道M细胞分泌组分析凸显该方法在从头发现细胞类型特异性分泌因子中的效用：发现气道上皮特异性表达的分泌型IgA受体FcαμR；鉴定VCAM1、ICAM1、GLYCAM1等细胞表面黏附蛋白，或构成M细胞-免疫细胞突触基础；基底侧分泌组中检出MHC II类蛋白，结合既往M细胞基底膜加载抗原于MHC II的认识，进一步提示M细胞可能参与囊泡介导的抗原转运。该遗传分泌组小鼠模型支持未来任一细胞类型在生理与病理条件下的分泌通讯研究。
