耐盐芽孢杆菌 Bacillus sonorensis 2MNHR 生物合成及表征硒纳米颗粒

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Biogenic synthesis and characterization of selenium nanoparticles by halotolerant Bacillus sonorensis 2MNHR

　　

硒纳米颗粒（SeNPs）因其独特的理化性质及在生物医学中的应用前景受到关注。研究人员采用从埃及地中海亚历山大港海水中分离得到的一株新型耐盐海洋芽孢杆菌 Bacillus sonorensis 2MNHR 进行 SeNPs 的胞外生物合成。从海水中获得十株形态不同的细菌分离株，评估其在有氧条件下还原亚硒酸钠（Na2SeO3）和硒酸钠（Na2SeO4）的能力；其中仅一株在 72 h 内于液体与固体培养基中均呈现特征性红色，表明持续还原亚硒酸盐，而对硒酸盐无还原现象。无细胞上清实验确认还原为胞外途径。上清液的紫外-可见（UV-Vis）与傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实生物分子参与亚硒酸盐转化，气相色谱-质谱（GC-MS）揭示多种可能负责还原与稳定的有机化合物。所合成 SeNPs 经 UV-Vis、FTIR、X 射线衍射（XRD）、zeta 电位、扫描电镜-能谱（SEM-EDX）及透射电镜（TEM）综合表征，确认为球形、非晶态纳米颗粒，粒径 80–200 nm（平均约 160 nm），UV-Vis 特征峰 226 nm，zeta 电位 ?38 mV，胶体稳定性高。SeNPs 对受试微生物抑制圈 23–32 mm，最小抑菌浓度（MIC）19.5–156.25 μg/mL；最小杀菌浓度/最小抑菌浓度（MBC/MIC）≤2 提示对多数细菌为杀菌作用，比值 4 提示对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为临界杀菌、对白色念珠菌（Candida albicans）为抑真菌。结果表明耐盐海洋细菌可作为稳定且具生物活性 SeNPs 的可持续生产平台。

研究背景方面，硒（Se）是维持细胞氧化还原稳态的必需微量元素，但亚硒酸盐等高浓度形态具毒性，微生物通过同化或异化途径将可溶硒氧阴离子还原为不溶单质硒（Se⁰）既可解毒又能形成功能纳米材料。相较于化学物理法，细菌介导合成具备绿色低耗优势；然而已有报道多孤立关注理化表征或生物评价，对耐盐海洋芽孢杆菌在控盐条件下胞外合成 SeNPs 并整合菌株筛选-表征-抗菌评估的系统研究不足。研究人员从埃及地中海亚历山大港东港夏季海水（约 37 °C）经 3.5% NaCl 的 LB 琼脂分离十株形态不同好氧菌，以 1 mM Na₂SeO₃ 或 Na₂SeO₄ 在液/固培养基 72 h 筛选，仅一株显红色并经无细胞上清实验证为胞外还原，盐耐受曲线（1%–5% NaCl）与 16S rRNA 测序（GenBank PX992226，100% 比对 Bacillus sonorensis）鉴定为耐盐 B. sonorensis 2MNHR。该文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。

主要关键技术方法概括：研究人员自亚历山大港海水样本经含 3.5% NaCl 的 LB 平板分离候选菌，采用液/固双相 1 mM 亚硒酸盐与硒酸盐还原显色初筛，阳性株经离心取无细胞上清加亚硒酸盐验证胞外还原；以梯度 NaCl（1%、2%、3.5%、5%）测生长动力学判定耐盐性；PCR 扩增 16S rRNA 并测序比对鉴定分类；发酵后离心收集颗粒，氯仿、70% 乙醇、蒸馏水洗涤纯化 SeNPs；联合 UV-Vis、FTIR、XRD、zeta 电位、SEM-EDX、TEM 及 GC-MS 分别解析光学特征、官能团、晶型、表面电荷、形貌元素与胞外代谢物；抗菌以 5 mg/mL 琼脂孔扩散测六株病原（含革兰阳性/阴性菌及 C. albicans 临床株）抑制圈， broth 微稀释法按 CLSI 定 MIC，再划线求 MBC/MFC 及比值。

研究结果部分各小节结论如下。分离与筛选小节：十株菌中唯 B. sonorensis 2MNHR 在亚硒酸盐液/固培养 72 h 变红，硒酸盐无响应。无细胞上清小节：24 h 培养上清加 1 mM 亚硒酸盐 72 h 仍显红，证胞外机制。盐耐受与鉴定小节：1% NaCl 最优，5% 仍长，属耐盐非嗜盐；16S rRNA 近全长序列比对定为 B. sonorensis 2MNHR。SeNPs 表征中 UV-Vis 小节：上清宽吸收 200–300 nm（吸约 3），纯 SeNPs 峰 226 nm（吸约 1）伴 326 nm 肩峰，示纳米硒与生物分子共存。FTIR 小节：上清 3460 cm^?1（O–H/N–H）、1637 cm^?1（酰胺 I）等；SeNPs 现 3371、1517、1417 cm^?1 等新峰，表明蛋白兼作还原与稳定剂。Zeta 电位小节：?38 mV 表高胶体稳定。XRD 小节：2θ 25°–35° 宽峰示非晶/弱晶。SEM/TEM/EDX 小节：SEM 见 110–200 nm 粒球状聚团，TEM 确 80–200 nm（均 160.03 nm）球形非晶，EDX 中 Se Lα 1.37 keV（原子 16.19%）伴 C/O/N/P/Na 示生物大分子包覆。GC-MS 小节：提取液主含 ethyl iso-allocholate、亚油酸、苯乙腈等，脂肪酸与芳香物或参与还原包被及膜破坏。抗菌与 MIC 小节：六株抑圈 23–32 mm，S. aureus 最敏（32 mm）；MIC 19.5–156.25 μg/mL；MBC/MIC 多数 2（杀菌），P. aeruginosa 为 4（临界），C. albicans MFC/MIC 4（抑真菌）。统计小节：双向 ANOVA 示 S. aureus 显著更敏（p<0.0001），革兰阴性间无显著差异。

讨论与结论翻译浓缩：研究人员指出该耐盐海洋株虽源自高盐环境却在 1% NaCl 最佳，体现广盐适应与渗透调节能力，与埃及地中海沿岸既往 B. sonorensis 分离记录一致，内生孢子助其抗逆。唯该株高效有氧还原亚硒酸盐，橙红显色与 226 nm 峰、非晶 XRD、?38 mV 电位、蛋白/脂肪酸包覆共同构成胞外生物合成证据；粒径 80–200 nm 与文献 Bacillus 源 SeNPs 相当。抗菌上革兰阳性 S. aureus 优敏于革兰阴性，可能与壁结构差异有关，MBC/MIC≤2 为主杀菌，对 P. aeruginosa 临界、对 C. albicans 抑真菌。结论为：自亚历山大港分离的耐盐 B. sonorensis 2MNHR 可经胞外途径绿色合成球形非晶、高稳定（zeta ?38 mV）、平均 160 nm 的 SeNPs，具 19.5–156.25 μg/mL 级 MIC 与广谱抗菌（杀细菌为主、抑真菌）活性，为对抗耐药菌及硒污染生物修复提供了可持续海洋微生物平台。