《TRENDS IN Biochemical Sciences》：Linkerology in PROTACs: learnings for proximity-inducing therapeutics
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靶向蛋白降解已迅速从化学生物学概念发展为一种治疗模式，首个蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera, PROTAC）降解剂现已被批准作为药物使用。连接子（linker）在调控三元复合物形成以及赋予双功能化合物类药性质方面发
靶向蛋白降解已迅速从化学生物学概念发展为一种治疗模式，首个蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera, PROTAC）降解剂现已被批准作为药物使用。连接子（linker）在调控三元复合物形成以及赋予双功能化合物类药性质方面发挥着核心作用。然而，连接子优化仍然是降解剂设计中最缺乏合理化的步骤之一。本综述引入了一个连接子学（linkerology）框架，该框架将基于数据的PROTAC连接子化学型分析与历史背景、代表性案例研究、新兴的基于邻近的模式以及临床阶段趋势相整合。研究人员揭示了所探索的连接子空间中持续存在的偏向性，并确定了在临床阶段降解剂中被优先保留的连接子特征。这些见解共同将连接子学定位为PROTAC设计中的核心学科，并为下一代基于邻近的治疗剂的开发提供了指导。
作为双功能降解剂中的核心设计元素，连接子（linker）在靶向蛋白降解（targeted protein degradation, TPD）中扮演着关键角色。PROTACs是异双功能小分子，由E3连接酶配体、目标蛋白弹头（warhead）和连接两者的连接子组成。连接子不仅决定形成稳定且有利于泛素化的三元复合物所需的空间取向，还调节PROTACs的理化性质和药代动力学（pharmacokinetic, PK）行为，包括细胞渗透性、溶解性和代谢稳定性。连接子的长度、柔性或刚性、极性和整体化学组成影响PROTAC介导的降解效能和选择性。近年来，连接子学（linkerology）一词被提出，用于描述对PROTACs及其他双功能分子中连接子的系统研究与优化。该学科将连接子视为三元复合物几何结构、协同性（cooperativity）和类药性质的可调决定因素，而不仅仅是一个被动的连接器。
连接子设计全景：基于数据的连接子化学空间分析
通过对PROTAC-DB数据库（包含超过2700种不同的连接子结构）进行数据驱动分析，揭示了连接子化学空间的探索现状。化学多样性分析注释了八种常见结构基序：烷基（alkylic）、聚醚（(poly)ether）、酰胺和线性胺（amide and linear amine）、脂环（alicyclic）、芳香（aromatic）、三唑（triazole）、炔烃和烯烃（alkyne and alkene）以及功能化元素（functionalised elements）。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示连接子占据重叠而非离散的化学空间区域，反映了混合（hybrid）结构的普遍性。出现频率分析证实，柔性基序（烷基和聚醚）主导了该领域，而脂环、芳香、三唑和炔烃基序较少见且很少单独使用。这种不平衡反映了连接子探索中的系统性偏向，主要由合成可及性、商业可用性和易于调节长度驱动，而非对连接子化学多样性的刻意探索。超过70%的连接子包含两个或更多化学型，共现分析显示杂交集中在少数常见的柔性-刚性组合，刚性元素通常嫁接到柔性骨架上以引入几何控制，而不牺牲构象适应性。
结构性质
针对单一基序连接子的分析显示，端到端距离呈宽泛的单峰分布，中心约在12 ?；脂环和芳香基序集中在较短距离，而烷基和聚醚连接子覆盖全范围，后者几乎是唯一超长（>18 ?）连接子的来源。可旋转键数量呈现相同模式：烷基和聚醚基序占据高柔性端，脂环和芳香基序集中在低可旋转键数。混合连接子拓宽了这两种分布，反映了结合柔性和刚性段带来的更大几何多样性。这些趋势表明，已探索的连接子空间聚集在中长度、构象适应性骨架周围，刚性基序仅起次要的嫁接作用。
连接子学的历史演变：从双价配体到基于邻近的药物设计
早期药物化学与化学生物学原理
连接子学的偏向性源于早期设计选择、合成限制和概念框架。连接子学概念基础可追溯至20世纪70年代末至80年代初，当时双价配体和双底物酶抑制剂研究表明，药效团之间的连接子长度和组成可关键影响生物活性。20世纪90年代至21世纪初，这一概念通过基于片段的配体设计策略（包括片段连接、双位配体和早期化学诱导二聚化）逐渐形式化，这些双功能分子将连接子确立为明确的结构-活性关系（structure–activity relationship, SAR）变量，而非被动连接器。这些原理后来转化为小分子二聚化剂，包括同源PROTACs（homo-PROTACs），其采用线性烷基或聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）连接子。
从概念到PROTACs
这些原理直接带入了21世纪初最早的PROTAC设计，这些设计依赖较简单的连接子结构，最常见的是线性烷基链，主要出于合成可及性考虑而非合理的结构依据。在早期的几个例子（2001–2008年）中，连接子主要作为当时可用的E3连接酶和蛋白靶标配体之间的简单连接单元。随着乙烯和PEG连接子的广泛采用，该领域大幅扩展，PEG单元提供了可预测的柔性、高溶解性、多种确定长度的商业可用性以及在多种偶联条件下的稳健性能。结合小分子E3连接酶配体（如von Hippel–Lindau (VHL)和cereblon (CRBN)）和更好的靶标配体的发现，使得系统性的连接子长度扫描成为可能，支持了2015年里程碑论文以来PROTAC研究的快速增长。然而，PEG连接子的主导地位不仅反映了有利的理化性质，也反映了合成可及性。尽管柔性PEG链在某些系统中促进了三元复合物组装，但也引入了高极性表面积、膜渗透性差和代谢脆弱性等挑战，这些后来成为转化工作的关键瓶颈。
结构洞察重塑连接子设计
随着三元复合物晶体结构和系统性降解分析的出现，研究人员逐渐认识到仅靠连接子长度和柔性不足以解释PROTAC性能。靶头效能的提高并不一定转化为降解改善，这突显了偶联化学和连接子附着点在塑造生产性三元复合物中的关键作用。附着点（exit vector）的细微变化可深刻改变降解谱，即使弹头和E3连接酶结合相同。在实践中，这些效应与偶联化学本身密切相关。弹头或E3连接酶配体上的官能团限制了可能的附着位点，从而限制了可引入的连接子的取向和化学性质。因此，连接子设计越来越多地反映了组装双功能分子的合成策略。
随着结构和机制洞察的积累，该领域开始认识到高度柔性亲水连接子的局限性。这促使脂环（如哌啶、哌嗪、氮杂环丁烷和环己基）的引入，它们提供适度的刚性、改善的极性控制和更明确的引出向量，同时保持优异的合成可行性。这些基序迅速广泛用于降解剂中，实现了对整体PROTAC行为的更严格控制。杂芳环连接子被评估为平面刚性元素，能够强制向量取向并调节极性，有时直接与靶标或连接酶相互作用。同时，1,2,3-三唑（可通过CuAAC点击化学获得）日益被用作具有固定取向和可预测几何结构的最简刚性元素，实现了高效的连接子扫描和线性及引出向量方向的精确控制。当作为引出向量定义元素时，三唑还可通过芳香或氢键相互作用与靶标或E3表面结合，有助于稳定三元复合物。然而，其中心区域掺入可能带来去溶剂化惩罚和增加的极性，导致膜渗透性降低。在此优化背景下，线性刚性化元素如炔烃间隔子被引入，以在柔性有害的系统中进一步约束连接子几何结构。
现代连接子工程时代
在连接子进化的最新阶段，出现了多价PROTAC结构，其中连接子本身作为中心“嫁接”支架而非被动连接器。这包括大环PROTACs，其中分子内环化用于预组织连接子几何结构并减少构象熵，以及完全多价设计，即降解剂在单一分子支架中包含两个以上功能结合元件。代表性例子包括大环PROTACs、同源三价降解剂（如SIM1）和能够募集两种E3连接酶的异源三价设计（如AB3067及相关类似物）。
