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氨基酸除营养价值外，在医学中亦具有相关性，且由于其化学特性，在制药、化妆品、动物饲料、食品及饮料工业等诸多领域不可或缺。在本研究论文中，研究人员报道了一种通过理性设计、随机诱变及途径工程构建的、用于从CO2生产亮氨酸的古菌细胞工厂（arc
氨基酸除营养价值外，在医学中亦具有相关性，且由于其化学特性，在制药、化妆品、动物饲料、食品及饮料工业等诸多领域不可或缺。在本研究论文中，研究人员报道了一种通过理性设计、随机诱变及途径工程构建的、用于从CO2生产亮氨酸的古菌细胞工厂（archaeal cell factory）。该细胞工厂已通过生物工艺技术检验，并在生产率、产品质量及操作稳定性方面成功实现放大。在一项为期2天的补料分批（fed-batch）试验中，研究人员在150 L中试规模下，从CO2生产了181 g亮氨酸，平均体积亮氨酸生产率为65 mg L?1 h?1。一项详尽的技术经济分析（techno-economic analysis, TEA）表明，从CO2生产亮氨酸的推广在全球范围内已接近经济可行性。
论文解读：基于CO
2的亮氨酸中试规模生产——以产甲烷古菌为细胞工厂
氨基酸不仅是营养成分，还在医药、化妆品、动物饲料、食品和饮料等工业领域具有广泛用途。在20种蛋白质氨基酸中，支链氨基酸（branched-chain amino acid, BCAA）——缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸——因动物和人类无法自身合成而成为必需氨基酸，其中亮氨酸在运动营养、肌肉合成、疲劳恢复及减脂等方面具有重要价值。当前全球氨基酸市场规模巨大，亮氨酸市场预计以16.89%的年复合增长率增长。然而，传统氨基酸生产主要依赖大肠杆菌（*Escherichia coli*）和谷氨酸棒杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）以葡萄糖为底物的发酵工艺，存在与农业争地、碳排放等问题。因此，开发以CO
2等一碳化合物为原料的下一代氨基酸生产技术具有重要意义。近年来发现，固定CO
2的产甲烷古菌可天然分泌氨基酸，其中嗜热产甲烷菌*Methanothermobacter marburgensis*已在Power-to-Gas（P2G）系统中用于甲烷生产，且具备耐剪切力、细胞壁坚韧等特性，并已建立无标记诱变工具。基于此，研究人员选择亮氨酸作为概念验证目标，旨在构建基于M. marburgensis的古菌细胞工厂，实现从CO
2直接生产亮氨酸，并通过中试放大和技术经济模型评估其商业化潜力。该研究成果发表于《Trends in Biotechnology》。
研究人员开展的研究主要包括：通过随机诱变（乙基甲磺酸（ethyl methanesulfonate, EMS）诱变）结合有毒类似物4-氮杂亮氨酸筛选获得亮氨酸过量生产突变株；通过理性设计，在M. marburgensis中整合表达来自*Methanothermobacter thermautotrophicus*的天然乙酰羟基酸合酶（acetohydroxyacid synthase, AHAS）；对获得的突变株进行连续气体发酵和不同规模（1.6 L、10 L、100 L工作体积）的补料分批发酵验证；利用液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）定量氨基酸；通过分子对接预测异丙基苹果酸合酶（isopropylmalate synthase, IPMS）的亮氨酸变构结合位点，并进行体外酶活测定；最终建立技术经济模型（TEM）和敏感性分析。菌株均来源于实验室构建，无临床样本。
研究结果分述如下：
**遗传工程与随机诱变结合导致M. marburgensis亮氨酸过量生产**。研究人员首先通过随机诱变获得突变株，其特异性亮氨酸生产速率（q
Leu）和选择性较野生型分别提高8倍和15倍（P <0.01），且其他氨基酸及生长未受显著影响。测序发现IPMS编码基因中存在与亮氨酸变构抑制释放相关的单核苷酸多态性（L461F和A430V）。随后，通过整合表达AHAS
0，q
Val和q
Leu分别提高29倍和31倍；体外酶活显示AHAS
0可被亮氨酸和缬氨酸抑制约50%和35%。在AHAS
0基础上再进行随机诱变，筛选出E3、E4、A7三个突变株，其q
Leu再提高2–3倍，缬氨酸生产速率降低最多5倍，亮氨酸占全部20种氨基酸的比例最高达67%。这些突变株的IPMS基因出现G458S、G426R、A461V突变，且分子对接和酶活实验证实其变构抑制得以解除。由此获得首个古菌亮氨酸细胞工厂。
**连续气体发酵实现稳定亮氨酸过量生产，特异性最高达80%**。在连续培养中，研究人员比较了野生型、AHAS
0及三个突变株在不同稀释率（D）和微量元素组成下的表现。突变株A7的q
Leu在连续培养中达到0.043 g g
?1 h
?1，体积亮氨酸生产速率（LVPR）最高为0.012 g L
?1 h
?1，平均较野生型高10倍，较AHAS
0高4倍。高稀释率（>0.04 h
?1）结合6·NovaSign微量元素（NSTE）配方对q
Leu有正向影响。A7在至少8天内表现出稳定的亮氨酸生产，因此被选为进一步研究的细胞工厂。
**补料分批可获得高浓度亮氨酸**。在1.6 L补料分批发酵中，A7的平均LVPR为0.052 g L
?1 h
?1，与连续培养中最高值相当；最终亮氨酸浓度达1.8 g L
?1，是连续培养最大浓度的2.25倍，亮氨酸特异性保持在68%。由于补料分批中生物量较高（3.29 g L
?1），q
Leu（0.019 g g
?1 h
?1）低于连续培养（0.044 g g
?1 h
?1）。
**亮氨酸生产率与浓度可放大至中试规模**。研究人员将补料分批工艺从1.6 L放大至10 L，再放大至100 L工作体积（150 L反应器），总体积放大62.5倍。三个尺度下的生长曲线、亮氨酸浓度、甲烷生成速率（90–105 mmol L
?1 h
?1）以及亮氨酸特异性（约70%）高度一致。最终在100 L规模下，2天内从CO
2生产了181 g亮氨酸。
**技术经济分析揭示氢气价格和甲烷去向是主要成本因素**。基于TEM模型，研究人员考虑了两种配置：发酵产生的甲烷经蒸汽甲烷重整器（steam methane reformer, SMR）循环回用，或直接出售。以1500 m
3反应器为基准，敏感性分析显示，在可持续情景（绿氢+出售甲烷）下，亮氨酸生产成本为�8.80 kg
?1；在最具成本效益情景（灰氢+SMR）下，成本为�4.10 kg
?1，低于内部经济可行性阈值�8.40 kg
?1。当前实测参数下（LVPR为0.067 g L
?1 h
?1、DSP效率85%等），盈亏平衡成本为�9.35 kg
?1。市场调查显示，BCAA约占氨基酸市场7.6%，其中亮氨酸占30.9%；若采用4500 m
3总反应器容量，该工艺可满足全球亮氨酸市场约21%的份额。
在讨论部分，研究人员指出，整合AHAS
0使碳通量从CO
2到BCAA合成途径提高了100倍，但酶仍受产物部分抑制，未来可通过解除抑制和微调表达进一步提高产量。连续培养中q
Leu较高但生物量低，提示存在气液传质限制，可通过计算流体力学辅助等手段改进。甲烷作为主要副产物虽有利于下游处理，但碳通量偏向甲烷需要优化，SMR循环是实现成本效益的关键。总体而言，H
2价格和下游处理效率是决定经济性的主要瓶颈。
研究结论如下：本研究表明，利用产甲烷菌从CO
2进行碳中性氨基酸生产在技术上是可行的，且放大在经济上具有可行性。将M. marburgensis的亮氨酸生产整合到已有的发酵、蒸汽甲烷重整和/或氨基酸下游处理设施中，可使整个生产过程更加高效。随着可再生能源领域的发展，特别是绿色H
2或生物氢气生产技术的进步，M. marburgensis的氨基酸生产成本有望进一步下降。此外，能够获得廉价且高浓度CO
2和/或H
2尾气流的行业将受益于协同效应。因此，M. marburgensis是适用于从CO
2生产氨基酸以及未来其他大宗化学品的古菌细胞工厂。
