可扩展的4D生物制造工艺用于制造无支架成骨性骨痂植入物

《TRENDS IN Biotechnology》：Scalable 4D biofabrication process for the manufacture of scaffold-free bone-forming callus implants

　　

临界尺寸长骨缺损(critical-size long bone defect)仍是重大临床挑战，自体移植物或骨搬移术等治疗会导致供区病变、感染或无法恢复复杂骨结构。模拟天然骨折愈合的组织工程植入物提供了有前景的解决方案。然而，致密细胞构建体的可扩展性仍然缺乏。为此，研究人员使用具有流变学能力的牺牲性海藻酸盐生物墨水(sacrificial alginate bioink)生物打印了高细胞密度植入物。构建体在生物打印和软骨分化过程中由部分交联海藻酸盐支撑，随后通过选择性EDTA介导的海藻酸盐溶解生成无支架(scaffold-free)植入物。质量表征证实了软骨-成骨特征和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)基因上调。在免疫缺陷小鼠体内植入后，植入物经历软骨内骨化(endochondral ossification)，形成含有骨髓腔室的皮质骨和松质骨。与悬浮生物反应器的整合实现了人类尺寸概念验证植入物的生产。该工作建立了一种可扩展的4D生物制造工艺，该工艺将3D生物打印与可溶解的牺牲性海藻酸盐生物墨水相结合，并产生无支架、成骨性骨痂植入物。

**可扩展4D生物制造工艺制造无支架成骨性骨痂植入物的研究解读**

每年全球报告超过1.78亿例骨折，约1.9%发展为骨不连（nonunion），即骨折无法完全愈合，可能导致肢体置换或多次侵入性临时骨移植手术。目前欧盟内部生物打印组织工程构建体的临床转化仍十分有限，已获批的组织工程先进治疗药品（tissue-engineered advanced therapy medicinal product, TE-ATMP）中部分已撤回，制造和规模放大能力不足是主要瓶颈。发育工程学策略通过模拟软骨内骨化（endochondral ossification）这一软骨向骨转变的确定性生物学过程，在骨折修复中具有重要意义。骨膜祖细胞被招募至骨折部位，形成纤维软骨性软组织愈伤组织（soft fracture callus），随后经血管长入、重塑和矿化形成功能性骨组织。高细胞密度间充质凝聚是成功再生的关键步骤。虽然基于类器官的模块化组装已实现中尺度植入物，但存在尺寸有限、几何控制不足、可重复性和可扩展性差等问题。3D生物打印技术能够一次性生成大型几何定义植入物，但传统水凝胶等外源材料可能引发免疫反应并延迟宿主整合，因此牺牲性生物墨水成为有吸引力的策略。海藻酸盐作为常用生物墨水，通过预交联可改善打印性能。本研究旨在开发一种时间依赖的4D生物制造工艺，利用部分交联的牺牲性海藻酸盐作为临时模板，在高细胞密度3D生物打印后经软骨分化及选择性溶解，生成无支架、具有生物学和力学能力的骨痂植入物，并探索其规模放大可行性。

研究人员将人骨膜来源细胞（human periosteum-derived cell, hPDC）与部分交联海藻酸盐混合，通过3D生物打印制备高细胞密度构建体，在软骨诱导培养基中分化21天，随后用EDTA溶解残余海藻酸盐，形成无支架构建体并继续分化7天。体外表征包括流变学、活力、基因表达、组织学及力学测试；体内实验采用免疫缺陷小鼠皮下植入4周和8周评估骨形成能力；最后整合GMP级悬浮生物反应器进行细胞扩增、生物打印和灌注培养，制造人类尺寸概念验证植入物。该研究发表于《TRENDS IN Biotechnology》。研究建立了可扩展的4D生物制造工艺，解决了致密细胞构建体在临床相关尺寸、几何控制、可重复性和规模放大方面的挑战，为骨缺损再生治疗提供新途径。

主要关键技术方法包括：使用GMP级SCINUS悬浮生物反应器在胶原微载体上扩增hPDCs；将细胞以23×10⁶ cells/ml密度混入部分交联海藻酸盐生物墨水进行挤出式3D生物打印；在灌注生物反应器中进行软骨分化培养（流速25 ml/min，容积250 ml）；通过EDTA介导选择性溶解海藻酸盐生成无支架构建体。样本来源：hPDCs来自6名捐赠者（5女1男，年龄20–32岁）的骨膜活检，规模放大实验另取自1名51岁男性捐赠者。

研究结果如下：

**部分交联海藻酸盐具有增强的流变学性能，可用于复杂3D结构的生物制造**
通过向海藻酸钠中滴定不同浓度（10、19、26 mM）CaCl₂，发现19 mM配方在打印后具有显著更低的线宽（0.93±0.04 mm），即更高分辨率和精度；流变学测试显示19 mM和26 mM配方的储能模量（G′）和粘度显著提高。19 mM配方与23×10⁶ cells/ml hPDCs混合后成功打印大型复杂3D结构，细胞活力高。

**部分交联海藻酸盐在高细胞密度下允许细胞凝聚和聚集**
将3M、13M、23M cells/ml细胞密度打印成圆柱构建体，在软骨分化过程中观察形态变化。23M组在第21天灰度值（82.6%）和聚集面积（54.63±34 mm²）显著高于13M（60.5%，5.07±2.5 mm²）和3M（2.5%，0.46±0.15 mm²）；高密度组从第7天开始出现细胞聚集并逐渐融合，3M组无聚集。所有条件活力维持在89–93%。EdU染色显示高密度样品在第7天增殖增加，第21天随软骨成熟而下降。

**3D生物打印构建体在体外分化21天后具有稳定软骨表型**
qPCR显示COL2A1、OSX和IHH在高细胞密度组（23M）上调。胶原II免疫染色仅在13M和23M组第14天后阳性，第21天23M组丰富。Safranin O染色显示细胞分泌的ECM逐渐增多，23M组最终仅保留25%海藻酸盐区域（3M组93%，13M组40%）。力学测试显示3M组杨氏模量从78.14±9.8 kPa降至17.25±5.1 kPa，13M和23M组分别为76.68±8.6和74.94±14.4 kPa，差异可能与残余海藻酸盐和ECM分布相关。

**ALG-Day 21（23M cells/ml）构建体在免疫缺陷小鼠异位植入后显示部分成骨能力**
体内植入4周后，纳米CT确认皮质骨和松质骨形成，但组织学显示骨和骨髓主要在构建体周围，中心区域即使8周仍保持软骨且未矿化。

**海藻酸盐溶解生成无支架、独立软骨构建体（SF-Day 21）并上调软骨和前肥大标志物**
第21天EDTA溶解去除残余海藻酸盐，FTIR和¹H NMR证实藻酸盐去除。转录组PCA显示从第0天到第21天逐步软骨分化，溶解后基因表达路径改变。溶解后立即上调基质重塑基因（CTSB）和前肥大驱动因子（RBP4、PTH1R）；继续培养至第28天（SF-Day 28）上调矿化起始基因（ALPL、IBSP）并下调免疫相关基因（CXCL5、IL2RA、CD2）。相比未溶解的含藻酸盐构建体，无支架组织更显著表达软骨和成骨谱系基因。

**溶解后无支架（SF-Day 21和SF-Day 28）构建体在体内植入后显示完全成骨能力**
皮下植入4周后即形成完全发育的骨组织，包含皮质骨、松质骨和骨髓腔室。纳米CT组织形态计量显示8周时各组间有显著差异。SF-Day 28在8周时完全重塑为骨组织，无残留矿化软骨。

**整合的扩大规模生物反应器和生物打印工艺可制造人类尺寸概念验证构建体**
单供体来源hPDCs在GMP级悬浮生物反应器中于胶原微载体上从1×10⁶扩增至250×10⁶细胞，耗时30天。混合23×10⁶ cells/ml后打印两个环状构建体（高2.5 cm，直径2 cm），在定制灌注式生物反应器中以25 ml/min流速分化培养。第21天溶解海藻酸盐后继续分化至第28天，获得无支架独立构建体。FTIR确认藻酸盐完全去除；葡萄糖和乳酸显示第14至28天代谢活性增强。活/死染色显示高活力，Safranin O染色显示均匀的软骨sGAG分布，无纤维化区域。

讨论部分指出，部分交联海藻酸盐生物墨水具备三个优势：第一，无需沉积过程中交联即可保持复杂几何结构，减少细胞损伤；第二，海藻酸盐缺乏细胞结合位点，促使高密度细胞自聚集并启动软骨分化；第三，可选择性地溶解残余藻酸盐而不影响形状保真度，溶解后细胞产生ECM填补空隙。与含藻酸盐构建体相比，无支架植入物在体内表现为更高的矿化体积和显著重塑能力，形成完全重塑的骨单位。规模放大流程中，悬浮生物反应器满足所需细胞数量，灌注培养避免坏死核心。但当前体内验证仅限于免疫缺陷小鼠皮下模型，仍需在免疫活性大动物（如羊）正位缺损模型中验证，且需改善溶解后结构稳定性、建立供体批次间可重复性和GMP兼容质量控制。

研究结论为：该可扩展4D生物制造工艺整合了高细胞密度3D生物打印、可溶解牺牲性海藻酸盐生物墨水、软骨分化及藻酸盐溶解，生成无支架、成骨性骨痂植入物。体内植入后经历快速软骨内骨化，形成皮质骨、松质骨和骨髓腔室。该工艺可通过整合GMP细胞扩增、几何定义3D生物打印、灌注生物反应器分化及牺牲性生物墨水溶解实现规模放大，制造人类尺寸植入