《TRENDS IN Biotechnology》：Emerging applications of Kluyveromyces marxianus in precision fermentation
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马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一种新兴的微生物细胞工厂，具备生长速率快、耐热耐酸性强、底物利用谱广（包括二代原料）等特征。结合其显著的种内遗传多样性及遗传工程工具的最新进展，这些特性使该酵母成为利用精准发酵实现可持续生物制
马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一种新兴的微生物细胞工厂，具备生长速率快、耐热耐酸性强、底物利用谱广（包括二代原料）等特征。结合其显著的种内遗传多样性及遗传工程工具的最新进展，这些特性使该酵母成为利用精准发酵实现可持续生物制造的通用底盘菌株。研究人员系统总结了当前马克斯克鲁维酵母在生物乙醇、有机酸、风味化合物及酶类生物合成领域的开发进展，重点阐述了影响工艺性能的关键要素，包括基于高通量筛选的菌株选育、发酵体系构建，以及温度、pH、溶氧供应等核心操作参数。本综述既梳理了现有研究成就，也展望了将马克斯克鲁维酵母打造为稳健工业工作菌株的潜在发展方向。
马克斯克鲁维酵母的独特特性
马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）在工业生产与医疗健康领域的应用日益广泛，涵盖生物基化合物合成到益生菌制剂开发等多个方向。该菌株已被认定为“公认安全”（Generally Regarded as Safe, GRAS）物质，同时获得“安全资格推定”（Qualified Presumption of Safety, QPS）认证，为其食品领域应用提供了合规基础。该酵母的工业价值核心源于多重特性：其比生长速率可达0.75 h?1，是目前已报道的真核微生物中的最高值，可显著缩短工业发酵的菌体生长周期，例如大幅压缩发酵初始阶段的延滞期。此外，马克斯克鲁维酵母可代谢葡萄糖、乳糖、木糖等多元碳源，包括龙舌兰汁、糖蜜、木质纤维素生物质、乳清等可再生原料。与当前应用最广泛的酵母底盘酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不同，马克斯克鲁维酵母为 Crabtree 效应阴性菌株。酿酒酵母受 Crabtree 效应影响，即使在有氧条件下也需严格调控糖浓度以避免发酵途径产生乙醇；而马克斯克鲁维酵母在（微）有氧条件下无论糖浓度高低均以呼吸代谢为主，这一特性在需避免乙醇副产物的发酵过程中具备显著优势。除代谢特征外，该菌株对工业常见胁迫因子具备优异耐受性：可在 pH 2.5 的酸性条件下生长，最高耐受温度可达 52°C，但不同分离株间的基因型与表型多样性显著。目前其耐热与胁迫耐受的分子机制尚未完全阐明，近期研究提示细胞膜脂质组成变化及膜蛋白功能调控可能是相关表型的核心基础。高温耐受特性可减少发酵过程中的反应器冷却能耗，同时支持糖化与发酵同步进行的同步糖化发酵（Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF）工艺，该工艺可降低设备投入、缩短发酵周期、减少酶制剂用量、降低污染风险，最终使生产成本降低约 10%。耐酸特性则减少了生产过程中的 pH 调控需求，为有机酸工业合成提供了优势——若使用耐酸性较弱的微生物生产有机酸，中和反应每生产 1 吨有机酸（如乳酸）会产生约 1 吨石膏副产物，而马克斯克鲁维酵母可规避这一问题。
Box 1 马克斯克鲁维酵母的底物利用多样性
工业生物过程中，马克斯克鲁维酵母常采用添加优化浓度无机盐、维生素及微量元素的人工合成培养基培养，但其同时可高效利用多种低成本碳源，包括工业副产物流。乳清作为乳制品加工副产物，因高乳糖含量成为理想底物，马克斯克鲁维酵母携带的 β-半乳糖苷酶编码基因 LAC4 可代谢乳糖。未经处理的乳清直接排放会造成环境负担，其高生化需氧量（Biological Oxygen Demand, BOD）与化学需氧量（Chemical Oxygen Demand, COD）会引发水体污染。利用马克斯克鲁维酵母发酵乳清不仅可降低环境负荷（COD 去除率可达 79%），还可联产多种高附加值产品：包括乙醇、乙酸乙酯、菌体生物质、酶类、单细胞蛋白及 2-苯乙醇。糖蜜作为制糖工业副产物，同样属于低成本原料，尽管其含有的金属类抑制剂会影响发酵过程，但马克斯克鲁维酵母仍可高效将其转化为单细胞蛋白、菊粉酶、D-乳酸与乙醇。此外，马克斯克鲁维酵母天然具备代谢木质纤维素中己糖与戊糖（如木糖、阿拉伯糖）的能力，这一特征使其区别于酿酒酵母，成为二代生物炼制的重要候选菌株。不过，木糖利用效率仍是当前瓶颈，现有菌株工程研究主要聚焦于提升木糖转运与同化能力。木质纤维素原料预处理过程产生的抑制剂是另一应用障碍，而马克斯克鲁维酵母的强鲁棒性使其具备高抑制剂耐受性，在脱毒水解液中的发酵性能常优于酿酒酵母。综上，从营养组成可控的合成培养基到成分复杂的工业副产物流，马克斯克鲁维酵母兼具代谢灵活性与胁迫耐受性、耐热性，是可持续生物过程开发与多元原料转化为生物基化学品的理想平台。
上述工业相关特性与可再生低成本原料利用能力的结合，使马克斯克鲁维酵母成为大宗化学品、风味化合物、酶类（β-半乳糖苷酶、菊粉酶）及疫苗合成的理想宿主。近年来，马克斯克鲁维酵母分子工具箱持续完善，包括基因组尺度代谢模型（Genome-scale Metabolic Models, GEMs）、基因表达系统及多元工程工具，为其工业潜力挖掘提供了技术支撑。现有综述已分别讨论了该菌株在蛋白表达、有机酸合成及高温生物过程中的应用进展，本综述重点聚焦可用于优化马克斯克鲁维酵母精准发酵的技术与工具：首先梳理该菌株作为细胞工厂的核心应用案例，以及从菌株与原料筛选到目标产物选择的全流程挑战；其次阐述工艺优化的核心作用——提升产物滴度、生产强度与得率是释放这一新兴微生物工作菌株潜力的关键；最后总结面向特定发酵过程的菌株工程与性能改良工具的最新进展。
马克斯克鲁维酵母的生物多样性支持优质菌株筛选
马克斯克鲁维酵母可从乳制品（如酸奶）、土壤、龙舌兰发酵液等多元环境中分离获得，不同分离株的表型差异显著，例如乳糖利用能力、高温耐受性及其他胁迫抗性的分化，提示其存在显著的遗传多样性基础。近期群体基因组学研究发现了区别于其他谱系的特殊谱系，全基因组核苷酸分化度可达 4.8%；同时该物种存在倍性变异，涵盖单倍体、二倍体及少量三倍体菌株。与酿酒酵母不同，马克斯克鲁维酵母尚无研究通用的“参考菌株”，目前常用菌株包括 CBS 6556、CBS 397、CBS 712 与 NBRC 1777。鉴于种内多样性丰富，针对不同应用场景筛选最优菌株是保障性能匹配的核心前提。目前已针对不同产物筛选获得多株高性能菌株：包括 2-苯乙醇合成菌株、乙酸乙酯合成菌株、乙醇合成菌株、乳酸合成菌株、单细胞蛋白生产菌株及酶类合成菌株。另有研究系统比较了不同分离株的耐热性、耐盐性等表型特征，为定向筛选提供了数据支撑。种内多样性的存在意味着可通过表型筛选快速获得适配特定原料、工艺条件与目标产物的底盘菌株，大幅降低后续代谢工程改造的压力。
菌株选育与性能改良的技术路径
马克斯克鲁维酵母的菌株改良已形成“自然筛选-适应性实验室进化-代谢工程”的多元技术体系。高通量筛选技术可快速从大量分离株中识别具备目标性状（如高温生长能力、高产物合成速率、高抑制剂耐受性）的候选菌株，是降低后续改造难度的首要步骤。适应性实验室进化通过模拟工业胁迫环境（如高温、低 pH、高抑制剂浓度），诱导菌株发生正向突变，可在无明确分子机制的前提下快速提升菌株的工业适应性，例如针对木质纤维素水解液抑制剂耐受性的进化研究已获得多株高性能菌株。代谢工程则通过靶向修饰关键代谢通路实现产物合成能力提升：针对木糖利用瓶颈，研究人员已通过过表达内源木糖还原酶、筛选新型戊糖转运蛋白等方式提升木糖同化效率；针对有机酸合成，通过敲除竞争通路、强化目标产物外排系统实现了乳酸等产物的高滴度合成；针对酶类生产，通过启动子优化、密码子优化、GAL80 基因敲除等策略显著提升了 β-半乳糖苷酶、菊粉酶的合成水平。近年来 CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a 等基因编辑工具的成熟，实现了该菌株的精准、多轮基因编辑，包括无标记基因整合、多基因通路组装等；Cre-loxP 染色体重排技术、基因组改组等进化工程工具则进一步提升了菌株改良的效率。此外，基因组尺度代谢模型的应用可通过模拟代谢流分布预测关键靶点，减少传统试错实验的成本，为理性菌株设计提供了支撑。
精准发酵工艺优化的核心要素
发酵工艺参数调控是实现马克斯克鲁维酵母工业潜力的关键环节，核心优化目标为产物滴度、生产强度与得率的协同提升。温度调控需结合菌株特性与目标产物：耐热菌株可在 40-52°C 下发酵，既减少冷却能耗，又可降低杂菌污染风险，尤其适用于 SSF 工艺；但部分产物（如某些风味化合物）的合成对温度敏感，需平衡生长速率与产物合成的需求。pH 调控方面，该菌株的耐酸性允许在低 pH 条件下发酵，不仅减少中和试剂消耗，还可抑制杂菌生长，对有机酸类产物的合成尤为重要——低 pH 环境可减少产物降解，同时避免副产物石膏的生成。溶氧调控需结合代谢特性：作为 Crabtree 阴性菌株，充足的溶氧可保障呼吸代谢主导，避免乙醇等副产物积累，但过高的溶氧会增加能耗，需根据菌株耗氧速率与目标产物合成途径的需氧特征优化通气量与搅拌速率。底物补料策略也是重要优化方向：针对高底物浓度引发的渗透压胁迫或代谢产物抑制，流加补料工艺可维持底物浓度在适宜区间，提升菌体生长稳定性与产物合成效率；针对乳清、糖蜜等复杂底物，需优化预处理工艺以去除抑制剂，同时补充必要的氮源与微量元素以平衡营养供给。此外，发酵模式的选择也需结合产物特性：分批发酵适用于产物合成与生长偶联的场景，补料分批发酵适用于高底物转化率的产物合成，而连续发酵则适用于菌体生长与产物合成非偶联的场景，可提升设备利用率。工艺优化需与菌株特性匹配，例如耐热菌株适配高温连续发酵工艺，可进一步降低单位产物的生产成本。
当前挑战与未来展望
尽管马克斯克鲁维酵母的研究已取得显著进展，其工业规模化应用仍面临多重挑战。首先，种内遗传多样性的分子基础尚未完全阐明，不同谱系间的表型-基因型关联研究不足，限制了理性筛选的效率；其次，木糖利用、高产物耐受性等关键性状的分子机制仍需深入解析，以支撑精准代谢工程改造；第三，现有工艺大多基于实验室小规模研究，放大过程中的传质、传热、代谢调控规律仍需系统研究，以保障小规模工艺的工业化转化；第四，分子工具虽已逐步完善，但大片段 DNA 组装、多基因通路动态调控等工具仍有提升空间，以支撑复杂天然产物的合成。未来研究可聚焦于以下方向：一是结合群体基因组学与表型组学，构建菌株特性数据库，实现目标性状的精准预测与筛选；二是整合多组学数据与基因组尺度代谢模型，开展理性代谢工程改造，提升目标产物的合成效率；三是开展工艺放大规律研究，结合过程控制技术实现发酵过程的动态优化；四是进一步完善基因编辑与调控工具，开发适配工业菌株的无标记、多基因编辑系统，支撑复杂产物的合成通路构建。随着菌株选育、代谢工程与工艺优化的协同推进，马克斯克鲁维酵母有望成为继酿酒酵母之后的又一核心微生物细胞工厂，为可持续生物制造提供关键支撑。
