高温条件下膨润土中硒(IV)的归趋及微生物响应：迈向安全的核废料处置

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Selenium(IV) fate and microbial response in bentonite under high temperature conditions: Towards safe nuclear waste disposal

　　摘要
深地质处置库被广泛认为是长期储存高放射性废物的理想场所，而膨润土则是其中的关键密封材料。放射性衰变产生的热量可能导致温度在60℃以上持续较长时间，因此需要研究在潜在泄漏情况下，膨润土中的微生物如何影响放射性核素的迁移。本研究选取了饱和平衡水的西班牙膨润土微宇宙，向其添加亚硒酸钠（放射性同位素79Se的无活性类似物），并加入乙酸、乳酸、硫酸以及细菌群落。在60℃下进行厌氧培养后，发现膨润土中的微生物群落具有固定硒的能力。仅在添加了细菌群落的处理组中，在4至14天内检测到了无定形和单斜相的Se(0)纳米结构，这表明微生物参与了硒的还原过程。两个月后，所有微宇宙中都发生了可溶性硒的还原，但在添加了细菌群落的处理组中这一现象最为明显，硒的还原率达到了98.7–99.3%。通过扫描透射电子显微镜（STEM-HAADF）、场发射扫描电子显微镜-拉曼光谱（FESEM-Raman）以及扩展X射线吸收精细结构谱（EXAFS）分析，仅在添加了细菌群落的处理组中发现了由Se–Fe聚合体构成的铁硒矿（FeSe2）。EXAFS分析显示，Se–Fe配位壳层的距离为2.40–2.43 ?，这一结果支持硒的形成与生物活动密切相关。16S rRNA基因测序结果显示，耐热和耐高温的微生物种类有所增加，其中包括Tepidimicrobium、Stenotrophomonas和Pseudomonas等菌属，这些菌属此前已被发现与硒和铁的生物地球化学转化有关。总体而言，这项多学科研究证明，在高温条件下，与膨润土共生的微生物能够在短时间内将硒以Se(0)纳米结构或FeSe2的形式有效固定。

引言
高放射性废物代表着长期的辐射危害，因为其中的放射性核素可能持续存在数十万年。深地质处置库被国际公认为隔离此类废物、保护生物圈的最有效手段[80]。在芬兰、瑞典、西班牙和加拿大等国的处置库设计中，膨润土被广泛用作缓冲屏障[29][53]。为保持其完整性，POSIVA、SKB、ANDRA和NWMO等主要废物管理机构规定了金属容器表面最高温度不得超过100℃，以避免膨润土干燥、发生热变化以及容器腐蚀[29][31][53]。这类较高温度可能会持续数十年，系统温度往往会在60–70℃之间长期维持[35]。

要确保这些系统的完整性，就需要开展大量的多学科研究，因为必须证明屏障在长期内的地球化学和生物稳定性。尽管在处置库的后期阶段才可能出现完全饱和的水分条件，但为了预判潜在的系统故障，仍需评估各种短暂和最坏的情况。这些情况可能包括金属容器腐蚀、放射性废物泄漏、膨润土的膨胀能力下降、富含有机物的地下水渗入以及微生物活动。在这些最坏情况下，只要有水、有机物以及未压实的膨润土存在，微生物就可能开始活跃，通过氧化或生物矿化、酶促还原等方式影响放射性核素的命运[50][64]。

在高放射性废物中，79Se是一种极为重要的放射性核素，因其半衰期极长，介于6.5×10^4年至1.13×10^6年之间[2]。这种β射线发射体是235U和239Pu的裂变产物[27]，因此主要存在于受辐射的核燃料和放射性废物中[2][34]。除了放射毒性外，其氧化态（Se(IV)和Se(VI)）的化学毒性进一步加剧了其危害。一方面，79Se和75Se等放射性同位素产生的电离辐射会引发孔隙水的辐射分解，生成活性氧物种，从而加速容器腐蚀。此外，持续的辐射场还会改变膨润土的稳定性，通过累积的DNA损伤和氧化应激对当地的微生物群落施加选择压力[53]。这类辐射还能在水环境中诱发硒的非生物还原作用。Le Ca?r[38]指出，辐射会增强水的辐射分解，产生氢化电子和氢自由基等还原剂，以及羟基自由基等氧化剂。这些辐射分解产物具有足够的还原能力，可将Se(IV)还原为Se(0)，进而促进更低氧化态硒的形成[16]。另一方面，如Ruiz-Fresneda等人之前的研究所示，硒的化学毒性与其氧化态密切相关[67][65]。氧化态为Se(VI)和Se(IV)的硒比还原态的Se(0)和Se(–II)更具毒性、更易溶解，也因此更易被生物利用[65]。先前的研究也发现，高放射性废物中的主要硒氧化态为Se(IV)[13]。

在处置库运行的初期，预计会出现较高的温度，这将限制微生物的活动，降低当地膨润土微生物群落的多样性。不过，某些极端环境微生物可以通过形成耐久孢子等适应机制在如此恶劣的环境中存活下来[29]。Bartak等人[6]在90℃的条件下对膨润土进行了研究，发现该温度已足以抑制微生物的生长和活动，他们还在其中发现了多种耐热物种以及能形成孢子的耐热菌属，如Thermincola和Bacillus。由于温度应力会显著影响未来处置库中的微生物活动，因此深入研究这一因素对于预测不同处置场景下的微生物行为至关重要。

基于上述考虑，本研究旨在模拟早期系统故障时可能出现的最恶劣情况，其中温度是一个关键因素。在这种最坏情况下，富含营养物质的地下水渗入会导致膨润土失去压实性，同时，若铜容器出现故障，废物中的硒也有可能释放出来。本研究特意向膨润土微宇宙中添加硒，以此模拟容器故障导致硒进入黏土屏障的情景。此前的研究仅在温和温度条件下探讨过硒对膨润土微生物群落的影响[45][59]。例如，Povedano-Priego等人[59]在室温下，使用乙酸钠和甘油-2-磷酸作为电子供体，监测了西班牙膨润土微宇宙中硒的生物转化过程，观察时间最长为6个月。而Martinez-Moreno等人[45]则在28℃下，使用来自El Cortijo de Archidona的相同膨润土、Se(IV)添加剂、富含营养的条件以及细菌群落，将观察时间延长至一年，研究了类似的微宇宙系统中的微生物变化。在那些先前研究中，Se(IV)的还原主要导致了Se(0)相的形成，而并未检测到铁硒矿等Fe–Se矿物相。因此，尽管这些研究为对比提供了重要基础，但本研究的实验条件有所不同，包括更高的培养温度、不同的营养物质组成以及更短的硒监测时间。在此基础上，本研究在60℃的厌氧高温条件下，探讨了由膨润土、微生物、硒和铜板组成的更为复杂的第四纪系统中的硒生物转化过程，这一温度条件对应于处置库寿命初期的热演化阶段。为此，研究人员使用了西班牙膨润土制备了饱和水微宇宙，其中加入了作为79Se非放射性化学替代物的亚硒酸钠、作为电子供体的乙酸和乳酸，以及作为电子受体的硫酸。部分处理组还加入了专门的细菌群落，以加速微生物反应。重要的是，与以往着眼于长期变化的研究不同，本研究在4至14天到2个月的较短时间内监测了硒的转化路径，旨在捕捉短暂的转化过程和早期的相互作用。关于微生物对铜腐蚀作用的平行分析，将在另一篇专门的研究文章中讨论。综上，本研究采用多学科方法，探讨了60℃的高温及硒对西班牙膨润土微生物群落的影响，同时追踪了这种类金属元素的生物转化过程。这些研究结果为了解厌氧高温初期（持续2个月）膨润土相关微生物对硒的地球化学演变过程提供了重要见解。这种在恒定60℃下进行的2个月培养，实际上是对早期高温及潜在故障情况的简化短期模拟，并非对真实深地质处置库中逐渐发生的长期热演化的再现。

片段摘录
**膨润土的采集**
2021年2月，研究人员从西班牙阿尔梅里亚地区的“El Cortijo de Archidona”地质遗址采集了西班牙膨润土。采样是在无菌条件下使用土壤钻进行的，以避免外来微生物的污染。采样深度约为90厘米。采集到的样本被存放在实验室的4℃环境中，等待后续使用。

**饱和水膨润土微宇宙的实验设置**
在制备饱和水膨润土微宇宙之前，首先对膨润土进行了处理，以确保其完全干燥且质地均匀。

**培养期间的颜色变化**
在60℃下进行为期2个月的厌氧培养过程中，研究人员记录了不同微宇宙中的颜色变化。图2展示了每种处理组在初始状态（T.0）以及培养4天、14天、30天和60天后的颜色变化情况。补充图S2则展示了整个培养期间所有样本的颜色变化情况。其中，添加了细菌群落的处理组显示出最明显的颜色变化。

**Se(IV)生物还原及生物成因铁硒矿形成的假设过程**
在本研究所测试的实验条件下，亚硒酸盐的生物还原可通过细胞内的分子或酶促反应启动，这些分子或酶包括谷胱甘肽（含有还原型的-SH巯基）、还原型硫氧还蛋白、亚硝酸盐还原酶、亚硒酸盐/亚硫酸盐还原酶、亚硫酸盐还原酶以及延胡索酸还原酶[36]。一旦被还原，Se(0)可以积累在细胞内、细胞壁中，或被排出到外部介质中。

**本研究所得结果**

**结论**
总体而言，本研究的结果对于评估深地质处置库运行初期的潜在系统故障具有重要意义，这些故障可能包括高温、硒泄漏以及地下水渗透等问题。即便在高温环境下，某些细菌仍可能存活，并通过将硒还原为不溶性的Se(0)或促进稳定型Fe–Se矿物相（如铁硒矿）的形成，从而有助于硒的固定。这种固定作用发生在培养的初期阶段。

**资金支持**
本研究得到了西班牙政府“科学、创新与大学部”授予MLM的RTI2018–101548-B-I00号资助项目“ERDF：打造欧洲的方式”，以及同一部门授予第一作者的FPU20/00583号资助项目。此外，本研究还部分得到了西班牙科学、创新与大学部通过ACOMER项目提供的资金支持。

**CRediT作者贡献说明**
Mohamed L. Merroun：写作——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源提供、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、概念构建。
Cristina Povedano-Priego：写作——审阅与编辑、验证、方法学。
Mar Morales-Hidalgo：写作——审阅与编辑、原始稿件撰写、可视化、验证、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念构建。
Fadwa Jroundi：写作——审阅与编辑。

**利益冲突声明**
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

Mar Morales-Hidalgo | Cristina Povedano-Priego | Marcos F. Martinez-Moreno | Antonio M. Newman-Portela | Pier L. Solari | Fadwa Jroundi | Mohamed L. Merroun
西班牙格拉纳达大学科学学院微生物学系