《Journal of Food Composition and Analysis》：Robust LC–MS/MS Method for Quantification of Ascorbic Acid in Infant Formula and Heat-Processed Donor Human Milk: A Stabilization and Matrix Effects Mitigation Approach
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抗坏血酸是婴幼儿健康必需的抗氧化物；然而，因基质复杂、分析物不稳定及缺乏空白基质等效物，其在婴儿配方乳粉与人乳中的定量具有挑战性。本研究提出一种简便稳健的LC–MS/MS（液相色谱-串联质谱）方法，仅用20 μL样品即绕过标准加入法（standard addi
抗坏血酸是婴幼儿健康必需的抗氧化物；然而，因基质复杂、分析物不稳定及缺乏空白基质等效物，其在婴儿配方乳粉与人乳中的定量具有挑战性。本研究提出一种简便稳健的LC–MS/MS（液相色谱-串联质谱）方法，仅用20 μL样品即绕过标准加入法（standard addition）需求。该方法线性优异（R2 > 0.99）、精密度（CV <15%）、准确度（±10%）与灵敏度（LOD < 0.0375 μg/mL）。储备液与工作液分别在-20 ℃与-80 ℃稳定数月，免每日配制。优化提取大幅降低基质效应（matrix effects）。方法经认证婴儿配方乳粉标准物质外部验证，成功应用于商品样，存样再分析（incurred sample reanalysis）变异<20%。本验证方法为热处理捐赠人乳与婴儿配方乳粉中抗坏血酸常规定量提供实用工具，并可拓展至其他基质。
研究背景方面，抗坏血酸（ascorbic acid，维生素C）作为水溶性微量营养素，是胶原与神经递质合成中多种酶的抗氧化剂和辅因子，人体无法内源合成，须依赖膳食摄入。婴幼儿推荐摄入量约40–50 mg/d，哺乳期母体需120 mg/d；缺乏可致坏血病，近年美国儿科人群发病率回升。母乳通常为足月儿提供充足抗坏血酸，但在母婴禁忌、泌乳延迟或早产儿喂养场景下，婴儿配方乳粉与热处理捐赠人乳成为替代。监管规定配方乳粉每100 kcal至少含8 mg抗坏血酸，而人乳抗坏血酸浓度受母体因素、储存与热处理影响波动大，甚至检不出。现有定量面临两大瓶颈：一是无真正空白基质，标准加入法耗时耗力且低浓度不准；二是抗坏血酸水溶液易氧化，传统稳定剂（偏磷酸、高氯酸、EDTA、磷酸盐缓冲液）常干扰LC–MS/MS电离。已有HPLC-UV、HPLC-ED及LC–MS/MS多有用例，但标准加入依赖强、储备液稳定性评估不足、牛奶基质中共洗脱蛋白脂质引起电离抑制仍需数学校正。为此，研究人员在《Journal of Food Composition and Analysis》报道了一种以溶剂替代基质、免标准加入、长稳储备液、超高稀释结合蛋白沉淀压制基质效应的LC–MS/MS方法。
关键技术方法上，样本来自美国市售两大品牌足月、出院早产、住院早产配方乳粉（粉状与即饮）及两例热处理捐赠人乳（一例来自人乳库巴氏后冻存，一例来自商业无菌常温产品），并以NIST SRM 1869b认证乳粉与BIOIVT混合人乳为基准。仪器为Shimadzu Nexera X2 UHPLC耦合Sciex Triple Quad 6500，负离子电喷雾（ESI?）MRM监测175→115 m/z（分析物）与180.9→119 m/z（13C?内标）。色谱用ACE C18柱，0.1%甲酸水/乙腈梯度，进样3 μL。样品经25倍水稀、加内标、乙腈与0.1%甲酸水各500 μL沉淀、离心取上清再5倍稀，累计稀释约6500倍。校准曲线以乙腈:水1:1为替代基质，0.75–37.5 μg/mL八点，权重1/x2。验证遵从FDA/ICH M10生物分析指南，涵盖线性、准确度精密度、基质效应（斜率比法）、残留、稳定性、回收率与稀释完整性，并以SRM 1869b做外部验证，存样再分析（ISR）取12例-80 ℃存3月复测。
研究结果部分，3.1方法开发与验证中，C18柱与甲酸乙腈/水体系使抗坏血酸与内标2.3 min共洗脱，ESI?灵敏度优于正离子。线性与选择性方面，溶剂、配方乳粉、混合人乳三基质校准曲线R2均>0.99，LLOQ 0.75 μg/mL，LOD 0.0375 μg/mL（S/N=8），保留时间与峰面积CV分别≤0.81%与≤1.5%。准确度精密度方面，替代基质日内精度0.8–1.4%、准确度-2.9–3.3%，日间精度1.5–2.2%、准确度1.4–3.9%；标准加入法在配方乳粉与人乳中日间精度2.0–10.8%、准确度-6.0–3.2%，所有QC水平符合±15%（LLOQ±20%）接受限。基质效应方面，配方乳粉斜率比0.995（效应2.05%），混合人乳0.915（效应8.49%），均<10%，归因6500倍稀释与蛋白沉淀削减离子源共入量。残留方面，最高标曲后双空白无分析物或内标峰。稳定性方面，储备液-20 ℃六月差异<5%，工作液-80 ℃三月ULOQ/LLOQ变化<10%，三次冻融与自动进样过夜均稳；机制上50%乙腈营造贫质子环境抑制抗坏血酸自由基歧化至脱氢抗坏血酸（DHA）的质子依赖步骤。回收率方面，三基质94–104%，SRM 1869b实测892.9±46.9 μg/g、回收99.5±5.2%，落入认证范围854–940 μg/g。稀释完整性方面，100 μg/mL替代基质样25倍稀后准确度3.8%、CV 1.45%。3.2外部验证中，SRM 1869b冻融与自动进样稳定性实测886.1±33.2与863.9±39.0 μg/mL，佐证溶剂替代基质可行。3.3样品分析中，市售配方乳粉实测抗坏血酸高于标示，可达近十倍，符合标签低估与制造过量补偿预期，即饮配方开盖48 h内仍足量的安全余量；所有配方乳粉未检出DHA（dehydroascorbic acid），标签仅标ascorbic acid；两例热处理捐赠人乳与验证用混合人乳均未检出抗坏血酸，原文平均人乳本底50–90 μg/mL，远高于LOD折算不稀释样约0.9 μg/mL，故判为热处理损耗而非灵敏度不足，与Gates等（2024）七例美产人乳未检出一致；ISR十二样-80 ℃存三月复测差异均<20%。
讨论与结论翻译部分，研究人员在讨论中指出，无真空白基质下以溶剂替代基质加超高稀释可等价于标准加入，免去日常加标；乙腈为主溶剂使储备/工作液长效稳定，省去避光与每日新配；6500倍稀释联合蛋白沉淀将牛奶基质电离抑制压至可忽略，使外标直接定量可靠。结论部分原文意为：本研究开发并验证了一种简便、稳健、可重复的LC–MS/MS方法，用于婴儿配方乳粉与热处理捐赠人乳中抗坏血酸的直接定量，适于常规分析；广泛稳定性研究证实储存、操作与分析全程稳定，溶液稳定化无需避光、减少新配频次；三基质验证确立替代基质等价性，摒弃标准加入；提取流程结合蛋白沉淀、高倍稀释与稳定同位素内标13C?-抗坏血酸，将基质效应降至最低，性能媲美标准加入；方法的稳定性、重复性与稳健性使其适用于常规分析，并有望拓展至其他含抗坏血酸的食品与生物基质。
