综述：细胞内铜绿假单胞菌：内化与存活

《TRENDS IN Microbiology》：Intracellular Pseudomonas aeruginosa: internalization and survival

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会性人类病原体，可在多种组织中定殖并建立高复发率的慢性感染。铜绿假单胞菌在多种细胞类型中存活，包括来自人类患者的活检组织。细胞内细菌部分免受免疫系统、跨真核膜渗透性差的抗生素以及在某些情况下还能免受渗透真核膜的抗生素（如氟喹诺酮类）的影响。这表明铜绿假单胞菌可建立一个细胞内储存库，可能有助于慢性感染和复发。然而，对铜绿假单胞菌的细胞内生命周期知之甚少。在本综述中，研究人员总结了铜绿假单胞菌与真核细胞相互作用的方式，以及其蛋白分泌机制在建立细胞内生态位中的作用。

**Adhesion to the surface of the host cell and internalization**
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）内化进入非吞噬细胞依赖于其粘附宿主表面并诱导摄取的能力。主要粘附素包括鞭毛（Flagella）、IV型菌毛（Type IV pili, T4P）、凝集素（Lectins）、孔蛋白OprF以及胞外多糖（Exopolysaccharides, Pel、Psl和藻酸盐）。鞭毛通过FliC和FliD组分与粘蛋白和上皮细胞相互作用，促进粘附，并激活宿主表皮生长因子受体通路及下游PI3K/Akt信号通路，促进细菌进入。IV型菌毛驱动蹭行运动，介导表面附着，并与宿主N-聚糖相互作用，通过激活PI3K/Akt通路诱导细菌摄取；其与T3SS的协同作用对宿主细胞定殖至关重要。凝集素LecA与宿主鞘糖脂Gb3结合，通过脂质拉链机制诱导膜内陷；LecB与岩藻糖基化受体相互作用，触发PI3K激活与caveolin-1募集的正反馈环，增强内化，并诱导β1-整合素内化导致上皮去极化。OprF作为粘附素，与宿主蛋白激酶C-α（PKC-α）磷酸化相关，增加中耳上皮细胞内化，同时通过调控T3SS等毒力因子间接影响胞内存活。胞外多糖Psl促进初始附着，并可能影响鞭毛素诱导的NF-κB激活；三种胞外多糖均具有抗吞噬活性，参与免疫逃逸。

**Secretion of active components**
铜绿假单胞菌与宿主细胞接触时，分泌多种毒力因子。III型分泌系统（T3SS）通过针状纳米机器将效应子注射入宿主细胞。效应子包括ExoY、ExoT以及互斥的ExoS或ExoU。ExoS具有GAP结构域（破坏肌动蛋白细胞骨架）和ADPRT活性（抑制吞噬、自噬、溶酶体酸化，诱导膜泡形成）；ExoT具有类似活性，通过靶向Crk1/2抑制NLRC4炎症小体；ExoU是一种磷脂酶，导致快速坏死性细胞死亡；ExoY是一种核苷酸环化酶，通过产生环状核苷酸破坏微管和内皮屏障。T3SS转座子本身可形成孔道并诱导细胞死亡。VI型分泌系统（T6SS）包括H1-、H2-、H3-和H4-T6SS。H2-T6SS递送磷脂酶D效应子PldA/PldB，通过刺激PI3K/Akt通路增强细菌摄取；TplE靶向内质网（ER），诱导未折叠蛋白反应和自噬；VgrG2b与γ-微管蛋白环复合物相互作用，增加细菌摄取，并被caspase-11切割后抑制NLRP3炎症小体。H2-T6SS还通过Azu和ModA效应子获取铜和钼酸盐。H3-T6SS效应子TseF参与铁获取，TepB促进生物膜形成。其他分泌系统（T1SS、T2SS、T5SS）以及群体感应（QS）分子、鼠李糖脂、吩嗪、铁载体和膜囊泡对胞内存活的影响尚待研究。

**Adaptation to the intracellular niche**
内化后，铜绿假单胞菌首先存在于含铜绿假单胞菌液泡（PCVs）中，部分细菌表达生物膜形成蛋白CdrA。胞内铜绿假单胞菌在上皮细胞内形成大型细胞内聚集体“pods”，对头孢他啶和环丙沙星具有耐药性。胞内细菌可通过T3SS转座子依赖的Ca²⁺内流逃逸至胞质，该过程依赖胞外细菌的T3SS。缺乏活性T3SS的菌株无法逃逸PCV，常分离自慢性感染。逃逸后，铜绿假单胞菌在ExoS依赖的膜泡内表现出泳动运动，并可通过T4P在胞质内迁移。在膀胱上皮细胞中，胞内菌主要位于LAMP-1阳性区室，上调T3SS和pyoverdine生物合成，下调LPS O-抗原合成和phoQ。其存活依赖AlgZR双组分调控系统。在吞噬细胞中，铜绿假单胞菌通过形成聚集体和生物膜逃避巨噬细胞和中性粒细胞，胞外多糖限制多形核白细胞渗透，群体感应激活的鼠李糖脂抑制吞噬作用。此外，H3-T6SS突变体利用巨噬细胞产生的衣康酸增强代谢，L-乳酸被确定为潜在碳源。宿主适应性进化显示，囊性纤维化（CF）适应菌株通过表达严格反应调节因子DksA1在CF巨噬细胞中存活更好，而lasR功能丧失突变与慢性感染相关。

**Host cell egress**
铜绿假单胞菌可通过依赖T4P和蹭行运动的机制或诱导宿主细胞裂解而离开宿主细胞。菌株还可诱导多种上皮细胞形成膜泡，在ExoS依赖下于膜泡内复制，膜泡脱落可能代表一种播散策略，同时保护细菌免受免疫系统和抗生素攻击。

**Therapeutic strategies targeting intracellular P. aeruginosa**
针对胞内铜绿假单胞菌的特定治疗策略较少。某些抗生素组合（如利福平-多粘菌素B、抗生素与抗菌肽TM5联合）显示出潜力。脂质体递送平台（如阿米卡星、环丙沙星、妥布霉素脂质体）和功能化纳米颗粒（携带粘菌素和LL-37）可提高胞内抗生素浓度。免疫调节方法（如诱导M1巨噬细胞极化）和抗体疗法（增强调理作用）可促进巨噬细胞杀伤。抗毒力策略（如T3SS抑制剂）可能抑制液泡逃逸，促进吞噬溶酶体杀伤。这些方法在临床前模型中的疗效仍需进一步验证。

**Concluding remarks**
尽管有证据支持胞内铜绿假单胞菌的普遍性和重要性，但其细胞内生活周期的不同阶段（液泡和胞质状态）仍大部分未知。与其他胞内病原体相比，对胞内铜绿假单胞菌的基因表达、营养需求、蛋白分泌系统和QS调控毒力因子的激活状态了解甚少。胞内铜绿假单胞菌表现出增强的抗生素耐受性，可能部分归因于生物膜样聚集体或较低的胞内生长速率。需要进一步研究其生理状态和存活策略，以开发减少复发频率的新策略。