综述：CAG重复扩增疾病中的可变剪接失调

《TRENDS IN Neurosciences》：Alternative splicing dysregulation in CAG repeat expansion diseases

　　

可变剪接（alternative splicing）是增加基因表达复杂性的高度调控过程，剪接中断会导致细胞功能显著破坏，并最终引发疾病。这种剪接病变（spliceopathy）在CTG重复扩增疾病——1型肌强直性营养不良（myotonic dystrophy type 1）中得到例证，其中可变剪接失调驱动核心疾病症状。最近，在小鼠和患者来源的疾病模型中的多项研究证明，类似的可变剪接变化在CAG重复扩增疾病中普遍存在，包括亨廷顿病（Huntington’s disease）和多种脊髓小脑性共济失调（spinocerebellar ataxias, SCAs）。本综述总结了目前关于CAG重复扩增疾病中可变剪接失调的知识，重点介绍了可能失调的基因和通路，并讨论了可变剪接失调可能促进疾病发病机制和患者症状的机制。

人类健康与疾病中的可变剪接

RNA剪接是调控细胞增殖、存活和分化许多方面的重要生物学过程。组成型剪接（constitutive splicing）从pre-mRNA中去除内含子并按顺序连接外显子以形成成熟mRNA，而可变剪接（alternative splicing）改变保留哪些外显子和内含子，从而从同一pre-mRNA产生多种不同的成熟mRNA。可变剪接是一种基础且高度调控的机制，通过从同一DNA序列产生不同的外显子组合，显著增加遗传多样性，导致成熟mRNA和蛋白质产生不同的功能、亚细胞定位及表达谱。这种严格调控的过程受顺式作用（cis-acting）RNA序列和结构、反式作用（trans-acting）剪接因子以及转录物表达的调控。转录组范围的研究表明，大约90–95%的人类基因表现出某种程度的可变剪接，超过40%的所有蛋白质编码基因产生多种蛋白质亚型。大约65%的可变剪接事件是组织特异性的，突显了可变剪接在组织分化和功能中的关键作用。例如，在神经系统中，轴突形成需要严格调控的可变剪接，在细胞骨架动力学、信号传导和支架中起指导作用，以实现轴突规范、寻路和稳定。RNA结合蛋白（RBPs）的表达水平在神经成熟过程中动态变化，强调了它们在塑造正常大脑发育中的关键作用。神经系统的广泛异质性与对剪接因子的高需求相结合，使转录后调控至关重要，并使神经元组织特别容易受到剪接缺陷的影响。单个基因水平的剪接异常可能源于调节剪接因子的组成、定位和活性的改变，以及影响核心剪接机制的致病性变异，包括顺式作用序列元件和反式作用因子。非编码区的单核苷酸变化等单个基因座内的突变可以激活隐蔽剪接位点、破坏经典剪接连接并改变严格调控的可变剪接程序。这些基因特异性缺陷可能改变亚型平衡、引入提前终止密码子、改变阅读框或产生具有异常组成和功能降低的蛋白质。通过这种方式，离散基因剪接保真度的破坏会损害RNA加工和蛋白质输出，最终损害细胞功能。除了基因座特异性缺陷外，许多疾病还以转录组范围的可变剪接失调为特征，导致数百至数千个转录物发生协调改变。RNA测序研究（Box 1）揭示了肌肉营养不良、Fuchs角膜内皮营养不良和肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆（ALS/FTD）等疾病中的广泛亚型失衡。全局剪接破坏最近已成为CAG重复扩增神经退行性疾病的一个特征，包括亨廷顿病和多种脊髓小脑性共济失调（SCAs）。虽然CAG疾病中这些转录组变化的机制驱动因素仍不清楚，但来自研究充分的CTG重复扩增剪接病变——1型肌强直性营养不良（综述于Box 1相关文献）的见解可提供一个概念框架。

可变剪接的分子机制

组成型剪接和可变剪接都涉及从pre-mRNA中去除内含子并连接外显子以形成成熟mRNA。这两个过程都受到核心剪接信号的严格调控：5′剪接位点、3′剪接位点、分支点序列和辅助序列元件（图1A）。这些关键序列元件的识别以及剪接反应的完成由剪接体（spliceosome）控制，剪接体是一种大型、高度动态的核糖核蛋白大分子复合物。虽然组成型剪接可以受剪接位点强度和核心剪接体组分可用性的调控，但可变剪接是一个更复杂且高度动态的过程（图1B）。可变剪接有七种主要模式：盒式可变外显子或外显子跳跃（SE）、可变5′剪接位点（A5SS）使用、可变3′剪接位点（A3SS）使用、互斥外显子（MXE）、内含子保留（RI）、可变启动子和可变多聚腺苷酸化（图1C）。值得注意的是，SE是脊椎动物中最普遍的可变剪接模式，而内含子保留在低等后生动物中最常使用。在许多真核生物中存在两种类似的剪接体：主要或U2依赖的剪接体，切除约99.5%的内含子；次要或U12依赖的剪接体，切除约0.5%的内含子。主要剪接体由五种小核核糖核蛋白（snRNPs）组成，它们单独（U1和U2）、作为二-snRNP复合物（U4/U6）或作为三-snRNP复合物（U4/U6/U5）发挥作用（图1A）。剪接体显示出显著的组成和结构灵活性，以确保组成型剪接中pre-mRNA剪接位点的准确识别，同时允许在可变剪接期间剪接位点选择的灵活性。当剪接体组分识别并结合pre-mRNA中的5′和3′剪接位点时，会发生两个连续的转酯反应，导致内含子被去除并连接相邻的外显子（图1A）。该过程是导致组成型剪接还是可变剪接，受剪接位点强度、顺式作用序列元件的复杂网络、反式作用因子（包括RBPs）、外显子长度和RNA二级结构的控制。与共有序列密切匹配的“强”剪接位点很容易被剪接体识别并通常组成型加工。相比之下，“弱”或次优剪接位点识别效率低下，产生竞争环境，从而出现可变剪接。在这些条件下，剪接位点在内含子去除和外显子连接期间以较低频率使用，导致不同成熟mRNA亚型的比例可变。剪接位点选择受顺式作用元件的内在强度和反式作用剪接因子的调控，这些因子结合外显子和内含子内的特定调控基序。这些基序包括外显子剪接增强子、外显子剪接沉默子、内含子剪接增强子和内含子剪接沉默子（图1B）。在盒式外显子调控中，剪接激活因子（如富含丝氨酸/精氨酸蛋白）招募到增强子元件可促进次优剪接位点的识别以促使外显子包含，而异质核糖核蛋白结合到沉默子元件通常有利于外显子排除（图1B）。重要的是，异质核糖核蛋白结合的调控结果高度依赖环境，因为相对于剪接位点的位置效应可以逆转其功能，从而扩展其调控能力。因此，正确的可变剪接依赖于适当的顺式作用元件、剪接体组装的忠实进程、特定的RNA–RBP相互作用以及多种剪接因子以组织特异性方式的协调作用。这些因素的任何改变都可能导致细胞功能障碍和疾病。

亨廷顿病发病机制中可变剪接的新兴作用

亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，以进行性运动功能障碍、认知能力下降和精神障碍为特征。亨廷顿病以纹状体中GABA能中型多棘神经元（medium-sized spiny neurons）的突出变性以及皮质萎缩（尤其是深层）为标志。该疾病源于亨廷顿（HTT）基因外显子1中的CAG三核苷酸重复扩增，编码亨廷顿蛋白中异常长的多聚谷氨酰胺（polyQ） tract。扩增长度与疾病外显率直接相关，并与发病年龄呈负相关，发病年龄范围从成年发病（≥40次重复）到严重青少年形式（>70次重复）。在亨廷顿病中，HTT亚型由隐蔽外显子包含、内含子保留和可变剪接位点使用的组合组成。尽管大多数亚型受到无义介导的衰变（nonsense-mediated decay）影响而没有功能后果，但HTT外显子1至外显子2的异常剪接（依赖于CAG重复）导致含有外显子1的小型多聚腺苷酸化mRNA。在人类和小鼠研究中，该亚型产生高度毒性的截短突变HTT蛋白。