《Journal of Virological Methods》：Development of an indirect competitive ELISA based on σC protein for detection of antibodies against avian reovirus
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摘要禽类呼肠孤病毒会导致家禽出现病毒性关节炎，而中国出现的新型变种使得血清监测显得更为重要。我们利用针对重组σC蛋白的单克隆抗体开发了一种间接竞争性ELISA检测方法。经过优化后——抗原包被浓度为6.0?μg/mL，单克隆抗体稀释比例为1:4000，封闭时间为90分钟，血清反应时
摘要
禽类呼肠孤病毒会导致家禽出现病毒性关节炎，而中国出现的新型变种使得血清监测显得更为重要。我们利用针对重组σC蛋白的单克隆抗体开发了一种间接竞争性ELISA检测方法。经过优化后——抗原包被浓度为6.0?μg/mL，单克隆抗体稀释比例为1:4000，封闭时间为90分钟，血清反应时间为60分钟，再次添加单克隆抗体的时间为90分钟——基于40份阴性血清，将临界抑制百分比设定为44.5%。该检测方法与六种常见禽类病原体无交叉反应，检测限为1:400的血清稀释度，且重复性优异（组内变异系数≤0.70%，组间变异系数≤7.70%）。对中国各地的87份现场血清进行检测后，总体血清阳性率为59.8%（不同地区的范围在50.0%至75.0%之间）。与市面上的IDEXX检测试剂盒相比，我们的间接竞争性ELISA检测出了52例阳性结果，而该试剂盒仅检测出48例阳性结果（χ2=4.32，P值=0.038），显示出更高的灵敏度。这种可靠、灵敏且特异的血清学检测工具非常适合用于大规模的ARV监测以及疫苗效果评估。
引言
禽类呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的一种无包膜双链RNA病毒。其病毒颗粒呈二十面体结构，直径约为70–80纳米，由双重衣壳结构构成（Spandidos和Graham，1976年）。该病毒的基因组由10个线性双链RNA片段组成，总长度约为23 kbp，根据其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移情况，可将其分为大、中、小三种类型（Benavente和Martínez-Costas，2007年；van der Heide等人，1981年）。S1基因片段编码σC蛋白，这是一种次要的外层衣壳蛋白，具有很强的免疫原性，参与细胞附着和病毒中和过程（Souza等人，2018年）。
禽类呼肠孤病毒可引发家禽多种疾病，其中病毒性关节炎/腱鞘炎带来的经济损失最为严重（Jiang等人，2021年）。该病毒感染主要影响脚趾关节、胫骨跖骨关节及肌腱，进而引发滑膜炎、腱鞘炎，严重时还会导致腓肠肌肌腱断裂以及关节软骨磨损。患病家禽会出现跛行、嗜睡、食欲减退以及饲料转化效率下降等症状，往往会导致死亡率上升（Jiang等人，2022年）。近年来，该疾病在中国日益普遍，相关的ARV变异株给家禽产业造成了严重的经济损失。
酶联免疫吸附试验因其高通量、快速且灵敏的特点而被广泛用于兽医诊断领域。在各类ELISA检测方法中，间接竞争性ELISA由于采用了样本抗体与标记的竞争物之间的竞争结合机制，因此具有较低的交叉反应性且特异性更高（Kohl和Ascoli，2017年）。当纯化抗体数量不足或样本中存在干扰物质时，这种检测方法尤为适用。与传统的间接ELISA相比，间接竞争性ELISA不仅能最大限度地减少非特异性结合，还能更灵敏地检测低滴度的抗体，这一点在我们与市面同类试剂盒的对比研究中得到了证实。因此，我们选择间接竞争性ELISA方法来开发一种适用于大规模监测的可靠血清学检测工具。
在本研究中，我们利用重组σC蛋白及特定的单克隆抗体，开发并验证了一种用于检测ARV特异性抗体的间接竞争性ELISA方法。我们对该方法进行了优化，并对其灵敏度、特异性和重复性进行了评估。研究结果表明，该检测方法是一种高效且经济实用的工具，非常适合用于大规模的血清学监测以及疫苗效果跟踪。
章节节选
病毒、阴性血清及现场样本
ARV SDLY毒株（GenBank编号为MF183217.1）最早是从中国山东省临沂市患病肉鸡的滑液及肌腱组织中分离出来的。抗H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒、禽白血病病毒以及网状内皮组织增生病毒的抗血清，是由山东农业大学家禽疾病研究所的刁友祥教授提供的。
重组σC蛋白的表达与鉴定
带有His标签的重组σC蛋白在E. coli BL21(DE3)菌株中得以表达，随后通过镍亲和层析技术进行纯化。SDS-PAGE分析显示出一个分子量约为49?kDa的明显条带，这一数值与预测的His-σC融合蛋白的大小一致（见图1A）。使用抗His单克隆抗体进行的Western blot分析进一步确认了纯化蛋白的身份，在预期位置出现了特异的免疫反应条带（见图1B）。这些结果
讨论
禽类呼肠孤病毒是一种全球范围内分布的病原体，主要通过引发病毒性关节炎和腱鞘炎给家禽产业带来巨大的经济损失（Jiang等人，2021年）。近年来，中国境内ARV变异株的流行率不断上升，给疾病控制带来了新的挑战，因为传统的诊断方法可能无法准确检测出由变异株引发的抗体（De Carli等人，2020年）。因此，开发一种高效且先进的血清学检测方法显得十分必要。
机构审查委员会声明
本研究已获得山东农业大学的动物实验伦理审查委员会批准（批准编号：# SDAUA?2022–199），并且所有实验均按照中国科技部制定的《实验动物指南》进行。
作者贡献
实验构思与设计：FW、JY、JD。实验操作：FW、JY、YY、HD、PZ。数据分析：FW、JY。论文撰写：FW、JY。
资金支持
山东农业工程学院优秀人才启动基金（编号：2025GCCZR?42）；山东农业工程学院优秀人才启动基金（编号：BSQJ202328）；国家博士后科研资助计划（编号：GZC20231503）；山东省重点研发计划（编号：2022CXPT005–04）。
CRediT作者贡献说明
冯伟：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿，可视化分析，结果验证，项目监督，软件应用，资源获取，项目管理，方法设计，研究实施，资金申请，正式数据分析，数据整理，概念构建。杨静：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿，可视化分析，项目监督，方法设计，研究实施，资金申请。何达林：论文撰写——初稿，项目监督，研究实施，资金申请。刁友江：论文撰写。
利益冲突声明
作者声明，本研究的开展过程中不存在任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系。
Feng Wei|Jing Yang|Yun Yan|Yupei Zhang|Dalin He|Youjiang Diao
中国山东省济南市山东农业工程学院农业科学与技术学院，邮编250100
