《Microbiological Research》：Nanopore-based epigenomic profiling reveals the absence of widespread CpG methylation in the African swine fever virus genome
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摘要DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，与DNA病毒的复制和转录调控密切相关。然而，感染猪类的大型双链DNA病毒——非洲猪瘟病毒的表观遗传特征仍存在争议。在此，我们使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）R10.4.1测序技术，系统地分析了在香港分
摘要
DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，与DNA病毒的复制和转录调控密切相关。然而，感染猪类的大型双链DNA病毒——非洲猪瘟病毒的表观遗传特征仍存在争议。在此，我们使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）R10.4.1测序技术，系统地分析了在香港分离出的首株ASFV毒株（HK_NT_202103）的DNA甲基组。我们采用了配对设计：原始全基因组测序与无甲基化的全基因组扩增对照样本进行比较。通过保守的阈值分析，我们在该病毒基因组中未发现5-甲基胞嘧啶（5mC）的存在，尤其是典型的CpG甲基化现象。重要的是，从WGS数据中成功检测到了宿主基因组中的明显CpG甲基化信号，这证明了该分析方法能够有效检测CG位点上的5mC。尽管没有发现广泛的5mC存在，但还是有少量潜在的N6-甲基腺嘌呤（6mA）位点被识别出来。有一个特定的6mA候选位点在原始离子电流信号中显示出异常，且与另一株ASFV分离株（CAS19-01/2019）在基因层面存在重叠，不过不同甲基化检测方法以及两种分离株之间并未出现单碱基一致性。虽然我们的生物学发现仅限于特定实验条件下的单一分离株，但这项研究为病毒表观基因组学研究提供了一种新颖且严谨的ONT分析框架。此外，ASFV中不存在CpG甲基化现象，表明去除宿主CpG序列仍是富集病毒宏基因组的一种可行策略。最终，我们的工作为ASFV监测提供了重要的方法学参考，同时也强调了针对罕见病毒修饰进行针对性实验验证的必要性。
引言
非洲猪瘟是一种高度传染且致命的猪病，其传播速度极快，全球范围内都面临着严峻的防控挑战，因此亟需开展有效的基因组监测与分析。该病的病原体为非洲猪瘟病毒，这是一种大型包膜双链DNA病毒，独特之处在于它既能在哺乳动物宿主体内复制，也能在节肢动物宿主体内复制（Njau等人，2021；Penrith和Kivaria，2022）。根据基因C端区域的序列差异，ASFV可被分为24种基因型（Barroso-Arévalo和Jurado-Díaz，2024；Z. Li等人，2022；O’Donnell等人，2024；Reis等人，2017）。2018年，中国境内爆发了大规模的ASFV II型疫情（Ge等人，2018；Wang等人，2018），2021年初，香港也报告了首例本地家猪养殖场疫情（Go等人，2023；Tam等人，2025）。在之前的研究中，我们成功对该首株香港分离株（ASFV HK_NT_202103，II型基因型）的完整基因组进行了测序和组装。通过结合纳米孔长读段与Illumina短读段优化技术的混合de novo组装策略，我们得到了精度极高的190kb连续病毒基因组。利用这一高质量基因组，我们基于关键标记基因和全基因组保守开放阅读框进行了全面的系统发育分析，为流行病学追踪和了解区域病毒演化奠定了重要遗传学基础（Go等人，2023）。在此基础上，我们最近开发了ANASFV这一综合生物信息学分析工具，旨在克服早期纳米孔R9.4.1测序的高错误率问题，从而实现更准确的ASFV全基因组组装和系统发育分析（K. Li等人，2025）。然而，尽管ASFV的基因组序列和遗传多样性已得到充分研究，但其基因组的表观遗传特征，尤其是DNA甲基化情况，至今仍大多未被探索。
DNA甲基化是一种重要的调控机制，能够整合环境与生物信号，进而影响基因组功能和基因表达（Abbas等人，2025；Portela和Esteller，2010）。在真核生物中，DNA甲基化的生物学意义早已得到明确证实，异常的甲基化模式与多种生理过程及疾病相关（Kolasseri等人，2025；M. Li等人，2024；Zhang等人，2025）。在病毒领域，DNA甲基化及其他表观遗传机制也被逐渐认为是调控病毒与宿主相互作用的重要因素，它们会影响病毒的基因表达、复制、潜伏状态以及免疫系统的识别能力（Tsai和Cullen，2020）。值得注意的是，已在多种大型双链DNA病毒中检测到DNA甲基化现象，这说明它也可能在这些病毒中发挥重要的调控或防御作用（Jeudy等人，2020）。
然而，多年来，关于ASFV基因组中是否存在DNA甲基化及其功能，学术界一直存在争议。在哺乳动物细胞中，胞嘧啶甲基化主要以CpG 5-甲基胞嘧啶的形式存在，这种甲基化形式可作为基因沉默的标志物（Mattei等人，2022）。由于ASFV主要在细胞质中复制，而宿主的DNA甲基转移酶则位于细胞核内，因此研究人员推测ASFV基因组中不应存在典型的CpG甲基化现象（Dixon等人，2013；Weber等人，2018）。基于这一假设，有研究者尝试使用甲基化DNA去除试剂盒来消除大量的宿主DNA背景，从而从临床样本中富集ASFV DNA（Masembe等人，2018；Ndlovu等人，2020）。但实际上，这种方法的有效性非常有限，未能显著提高ASFV基因组的测序覆盖率（Pereira De Oliveira等人，2020）。更为复杂的是，最近有一项利用纳米孔测序技术开展的全基因组研究指出，中国本土的某ASFV毒株可能存在全基因组范围内的5mC和N6-甲基腺嘌呤位点（Jia等人，2020；Jia等人，2021）。这就出现了一个关键的生物学矛盾：ASFV基因组真的存在甲基化现象，而这或许可以解释为何甲基化去除试剂盒无法发挥作用，同时也会彻底改变我们对ASFV复制机制的理解；还是说它的基因组完全不存在甲基化现象？我们认为，去除试剂盒效果不佳以及关于ASFV甲基化的不同观点，很可能受到技术干扰和背景噪声的影响，而采用更高精度的测序技术并结合严格的内部对照，有助于澄清这一争论。
由于宿主DNA背景过于丰富，再加上化学检测方法和生物信息学工具本身存在的固有偏差，要对病毒尤其是ASFV的甲基化情况进行分析在技术上极具挑战性（Shi等人，2024）。幸运的是，Oxford Nanopore Technologies提供了完整的解决方案，可直接克服这些难题。首先，与亚硫酸氢盐测序不同，ONT技术能够直接从原始离子电流信号中检测出经过修饰的碱基，无需进行亚硫酸氢盐转化之类的额外化学处理。其次，ONT技术的实时自适应采样功能可以筛选掉宿主序列，从而富集病毒DNA，达到进行可靠甲基化分析所需的较高测序覆盖率。再者，与需要大量错误校正才能实现准确组装的旧版R9.4.1平台相比，最新的R10.4.1流式细胞化学技术大幅提升了原始碱基调用精度，降低了假阳性出现的概率。最近的性能对比研究表明，R10平台在处理原始全基因组测序和全基因组扩增样本时，都能获得质量更高、更为一致的数据（Ni等人，2023）。不过，目前的甲基化检测算法大多是基于特定生物体（如人类或细菌）训练而来的，可能不太适用于病毒分析（McIntyre等人，2019；Yuen等人，2021）。正因如此，许多最新研究提出，应使用严格的阴性对照或开发不受生物种类限制的统计分析方法，以此规避这些训练带来的偏差（Guo等人，2025；X. Liu、Ni等人，2024；Lu等人，2025）。因此，结合先进的测序技术、自适应采样功能以及未经处理的对照样本，对于生成准确的病毒表观基因组谱型而言至关重要。
在此，我们利用可控的纳米孔测序框架，系统地分析了从野外分离得到的II型ASFV毒株（ASFV_HK_NT_202103）的DNA甲基化特征。为考虑序列和平台特有的背景噪声，我们采用了配对实验设计，将原始全基因组测序与无甲基化的全基因组扩增对照样本进行对比。我们的分析方法包含了三个关键要素，以确保评估的严谨性：首先，利用WGA对照样本为假阳性结果设定保守的判断标准；其次，利用来自同一原始文库的宿主猪源读取序列作为CpG 5mC检测的内部阳性对照；第三，结合多种甲基化检测工具与原始电流信号分析结果，共同评估5mC、6mA以及其他潜在的甲基化修饰类型。通过将这些分析结果置于ASFV基因组监测的实际背景下进行解读，我们旨在确定ASFV自身是否存在CpG甲基化现象，以及这种现象是否可以解释为何基于甲基化特征的宿主DNA去除方法效果不佳。最终，这项工作旨在更清晰地阐明ASFV基因组的CpG甲基化状况，为未来的病毒表观基因组学研究提供一套经过严格控制的分析方法参考。
章节节选
样本制备与纳米孔测序
样本取自香港特别行政区新界某本地养猪场的感染猪只的脾脏组织。我们使用FastPure Blood/Cell/Tissue/Bacteria DNA Isolation Mini Kit（Vazyme DC112）提取基因组DNA。为了进行全基因组扩增，我们设计了一组引物，其5'端重叠区域长度为5kb，能够覆盖整个ASFV基因组（见表S1）（K. Li等人，2025）。我们通过凝胶电泳检测了DNA的质量（见图S3）。随后，我们使用Ligation Sequencing Kit V14构建了DNA文库。
纳米孔测序策略与读段质量评估
我们采用了两种测序方法：原始全基因组测序，用于保留DNA的天然修饰状态；全基因组扩增，则用于生成未经修饰的对照样本。我们运用自适应采样技术来富集病毒相关的读取序列。在完成参考序列比对后，我们共获得了2,234条ASFV相关读取序列和2,368,732条宿主相关读取序列，其中病毒序列的比例仅为0.09%。宿主相关读取序列的中位长度相当低，不足1000bp（见图2B、图S1），这也说明自适应采样技术有效地过滤掉了宿主序列。与
讨论
在本研究中，通过严格控制的纳米孔测序框架，我们未在ASFV基因组中发现高频且具有足够证据支持的CpG甲基化现象。对于这一现象，一个合理的生物学解释可能是空间隔离效应。ASFV几乎只在宿主细胞细胞质中的病毒复制工厂内复制，而猪类的DNA甲基转移酶则主要存在于细胞核中（Larsen等人，2018）。这种物理上的隔离很可能限制了宿主DNA甲基转移酶接触到病毒基因组，从而导致病毒基因组中缺乏典型的CpG甲基化。
资金来源
本研究得到了香港特别行政区政府研究资助委员会的青年学者计划（CityU 21100521）和一般研究基金（项目编号11105524）、香港卫生医疗研究基金的资助（项目编号08194126），以及香港城市大学提供的新的研究启动项目支持（项目编号9610497），这些支持均用于资助R.L.开展本研究。
CRediT作者贡献说明
Xiuqi WANG：撰写——审阅与编辑。 Yanwen SHAO：实验研究、正式分析、数据整理。 LI Runsheng：撰写——审阅与编辑、研究指导、资源协调、项目管理、方法设计、资金申请、研究构思。 WU Xinyao：撰写——初稿撰写、实验研究、正式分析。 Zhihao GUO：撰写——审阅与编辑、软件应用、实验研究。
关于写作过程中使用生成式AI及AI辅助技术的情况声明
在准备本研究报告的过程中，作者们使用了ChatGPT来协助语言润色工作。作者们对内容进行了仔细的审核和修改，并对最终发表的内容负全部责任。
利益冲突声明
作者们声明，自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
WU Xinyao|Zhihao GUO|Yanwen SHAO|Xiuqi WANG|LI Runsheng
中国香港香港城市大学赛马会兽医及生命科学学院传染病与公共卫生系
