泼尼松联合双氢青蒿素通过靶向MAPK14抑制红斑狼疮皮肤角质形成细胞的过度激活

《Molecular and Cellular Probes》：Prednisone combined with dihydroartemisinin inhibits the excessive activation of skin keratinocytes in lupus erythematosus by targeting MAPK14

　　

背景：系统性红斑狼疮（SLE）是一种高度复杂的自身免疫性疾病，给治疗带来巨大挑战。其中，皮肤红斑狼疮（CLE）是最常见且最早的临床症状之一。双氢青蒿素（DHA）是青蒿素的半合成衍生物，提取自传统中药黄花蒿。近期研究表明，DHA具有免疫抑制效应。本研究旨在进一步探索DHA在SLE相关皮肤病变中的作用及其对角质形成细胞（KC）的影响。方法：研究人员通过腹腔注射降植烷（Pristane）诱导SLE小鼠模型，并采用CLASI评分系统评估皮肤损伤。通过苏木精-伊红（H&E）染色和马松（Masson）染色分析组织学变化。免疫荧光（IF）检测皮肤组织中IgG和C3沉积，免疫组化检测K16表达。通过紫外光照射小鼠KC建立体外SLE皮肤模型，随后采用EDU法检测细胞增殖，DCFH-DA荧光法测定活性氧（ROS）水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞因子水平，Transwell小室评估细胞趋化性。既往研究表明，MAPK信号通路参与泼尼松（PDN）和DHA治疗SLE，进一步通过MCODE分析鉴定出MAPK14为该通路的关键基因。结果：研究结果表明，PDN与DHA联合应用可减轻小鼠SLE相关皮肤损伤及KC的异常激活。机制上，研究人员发现PDN和DHA通过靶向MAPK14协同抑制KC的炎症激活，从而调节Treg/Th17平衡。结论：本研究强调了DHA在SLE相关皮肤炎症中的保护作用，并为其通过免疫调节途径改善KC异常激活提供了实验支持。

**论文解读**

**研究背景与问题**

系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多系统的自身免疫性疾病，其临床治疗主要依赖激素、免疫抑制剂、抗疟药、生物制剂及非甾体抗炎药等，但长期使用可能导致累积性器官损伤甚至功能衰竭。皮肤是SLE最常受累的器官之一，约80%的患者出现皮肤表现，如急性蝶形红斑、盘状红斑狼疮、光敏性红斑等。皮肤红斑狼疮（CLE）的病理特征表现为异常组织重塑和炎症反应，主要由基质金属蛋白酶（如MMP2、MMP9）和促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β）的失衡驱动。近年研究逐渐认识到，角质形成细胞（KC）是触发皮肤炎症的主要因素，尤其在Ⅰ型干扰素（IFN）产生中起关键作用。在紫外线或炎症刺激下，KC可异常激活并分泌多种促炎因子和趋化因子（如IL-6、TNF-α、CCL20），促进免疫细胞招募并放大局部炎症反应。因此，靶向调节KC的病理状态成为新的治疗策略。

双氢青蒿素（DHA）是青蒿素的活性代谢物，除抗疟作用外，还表现出免疫调节活性，并在SLE等自身免疫病中显示治疗潜力。既往研究提示，泼尼松（PDN）与DHA联合可通过MAPK信号通路调节M1/M2巨噬细胞平衡，从而减轻SLE系统性炎症，但该联合治疗对SLE皮肤病变的作用及其分子机制尚不明确。本研究旨在探讨DHA是否通过靶向MAPK14抑制SLE中KC的过度激活，并阐明其在皮肤炎症中的潜在机制。该论文发表在《Molecular and Cellular Probes》。

**关键技术与方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：1）通过腹腔注射降植烷（Pristane）诱导SLE小鼠模型，并利用CLASI评分系统评估皮肤损伤；2）采用苏木精-伊红（H&E）染色和Masson染色分析组织学变化及胶原沉积；3）免疫荧光（IF）检测皮肤组织中IgG、C3、p-MAPK14、K16、CD4、CD19、CD11c、IL-17A及Foxp3的表达及共定位；4）免疫组化（IHC）检测K16表达；5）通过紫外光照射小鼠KC建立体外SLE皮肤模型，并采用EDU法检测细胞增殖、DCFH-DA荧光法检测ROS水平、ELISA定量细胞因子（IL-6、TNF-α、IL-23、CCL20等）水平、Transwell小室评估细胞迁移；6）分子对接预测PDN和DHA与MAPK14的结合；7）Western blot检测MAPK14、c-JUN、NF-κB、IκB、STAT3、RORγt等蛋白及其磷酸化水平；8）流式细胞术检测Th17细胞比例；9）RT-qPCR检测IL-17A、RORγt、IL-23R mRNA水平；10）免疫共沉淀（CO-IP）验证MAPK14与IL-6的相互作用；11）通过慢病毒过表达MAPK14（OE-MAPK14）进行功能验证。所有动物实验均使用BALB/c雌性小鼠（6-8周龄），样本来源明确。

**研究结果**

**3.1 PDN与DHA联合治疗减轻SLE引起的皮肤损伤**
通过宏观评估、H&E染色、Masson染色、IF及IHC发现，与假手术组相比，SLE模型小鼠出现活动减少、毛色暗淡、背部皮肤损伤、表皮结构紊乱、炎细胞浸润、基底细胞液化、胶原沉积减少、IgG/C3沉积增加、KC激活标志物K16表达上调。单独使用PDN或DHA可部分改善上述指标，而联合治疗进一步显著减轻皮肤损伤、降低组织学评分、增加胶原沉积、减少免疫复合物沉积并抑制K16表达。体外实验中，紫外线照射小鼠KC后，PDN或DHA单独处理可抑制KC增殖、降低ROS水平、减少促炎因子（IL-6、TNF-α、IL-23、CCL20）分泌及抑制KC迁移，联合治疗组上述效应最为显著。

**3.2 PDN联合DHA通过MAPK通路抑制KC异常激活**
基于PPI网络拓扑分析及分子对接，研究人员聚焦于MAPK14。Western blot结果显示，PDN或DHA处理可抑制SLE小鼠皮肤及紫外线照射KC中p-MAPK14、p-c-JUN、p-NF-κB、p-IκB的表达，联合治疗组抑制效果最强。IF共定位显示p-MAPK14与K16在表皮层共表达，联合治疗显著抑制该共表达。表明PDN和DHA协同抑制MAPK14/c-JUN/NF-κB信号通路，减轻SLE相关皮肤炎症。

**3.3 PDN和DHA通过调节Th17/Treg免疫平衡抑制Th17介导的角质形成细胞炎症反应**
IF检测显示，SLE小鼠皮肤中CD4⁺ T细胞围绕KC显著浸润，而CD19⁺ B细胞和CD11c⁺树突状细胞浸润无显著变化。进一步分析发现，SLE皮肤中Foxp3⁺ Treg细胞减少，IL-17A⁺ Th17细胞增加；PDN或DHA处理可增加Foxp3⁺细胞、减少IL-17A⁺细胞，联合治疗组效果最显著。ELISA显示皮肤组织IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平降低。体外实验利用磁珠分选CD4⁺ T细胞并在Th17极化条件下诱导，流式细胞术证实PDN和DHA可抑制Th17细胞比例，Western blot和RT-qPCR显示IL-17A、RORγt、IL-23R蛋白及mRNA水平下调。通过Transwell共培养，经药物处理的Th17细胞可减少KC增殖、ROS产生及IL-6、TNF-α、IL-23、CCL20分泌，并降低KC迁移能力。

**3.4 PDN联合DHA通过靶向MAPK14调节SLE中Treg/Th17失衡**
STRING数据库预测IL-6与MAPK14存在相互作用，CO-IP实验验证了二者在KC中的结合。Western blot和IF检测显示，在Th17细胞中，p-MAPK14、IL-6、p-STAT3、RORγt表达升高；PDN或DHA处理可降低这些蛋白水平，联合治疗效果更明显。在动物水平，SLE小鼠皮肤中IL-6、p-STAT3、RORγt表达升高，PDN和DHA联合治疗可显著下调，并抑制p-MAPK14与IL-17A的共表达。表明IL-6通过与MAPK14相互作用激活STAT3-RORγt信号轴促进Th17分化，而PDN和DHA联合治疗可有效抑制该通路。

**3.5 PDN联合DHA通过靶向MAPK14改善SLE皮肤病变**
通过慢病毒过表达MAPK14（OE-MAPK14）进行功能验证。结果显示，与SLE+PDN+DHA组相比，OE-MAPK14组小鼠皮肤损伤加重、组织学评分升高、胶原沉积减少、IgG/C3沉积增加、p-MAPK14与K16及IL-17A的共表达增强。Western blot显示，OE-MAPK14部分逆转了PDN+DHA对p-MAPK14、p-c-Jun、p-IκB、p-NF-κB、IL-6、p-STAT3、RORγt的抑制作用。ELISA证实，OE-MAPK14使皮肤组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平回升。证实MAPK14是PDN和DHA联合治疗SLE皮肤病变的关键靶点。

**讨论与结论**

讨论部分指出，SLE的病因仍未完全阐明，皮肤受累的机制有待深入。本研究首次揭示PDN与DHA联合通过靶向抑制MAPK14，阻断KC异常激活并调节Th17/Treg免疫平衡，从而减轻Th17细胞驱动的皮肤炎症。DHA作为青蒿素衍生物，在系统性免疫调节方面已获认可，但其对SLE局部微环境中KC功能的直接影响尚需研究。本研究证实，DHA联合PDN可显著抑制KC异常激活及多种促炎因子和趋化因子的产生。MAPK14是p38 MAPK家族成员，在应激和炎症反应中起关键调控作用，分子对接及功能实验证实PDN和DHA可直接与MAPK14结合并抑制其下游信号。此外，SLE中Treg/Th17失衡是重要致病机制，本研究发现DHA（单独或联合PDN）可恢复Treg/Th17平衡，其机制与IL-6通过MAPK14激活STAT3-RORγt轴促进Th17分化有关，联合治疗通过靶向MAPK14降低IL-6水平进而纠正免疫失衡。研究局限性包括缺乏临床样本验证、MAPK14调控机制需进一步深入分析、其他MAPK家族成员的可能参与有待系统评估。

**研究结论**：本研究揭示了PDN和DHA可能发挥作用的潜在机制，即它们能够靶向抑制MAPK14，从而减轻红斑狼疮患者皮肤角质形成细胞的过度激活和炎症反应。这些发现表明DHA具有潜在的药理作用，并为其在SLE治疗中的应用提供了机制基础。基于其明确的安全性及本研究揭示的靶向机制，DHA在SLE临床转化中具有重要潜力。