1周慢性间歇性低氧对幼年大鼠睡眠期间咀嚼肌肌电活动的影响

《Neuroscience》：Aftereffects of 1-week chronic intermittent hypoxia on the jaw muscle electromyographic activities during sleep in young adult rats

　　

阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）与从儿童期到成年期广泛年龄范围内睡眠期间咀嚼肌活动的增加有关。然而，间歇性低氧对咀嚼肌活动的作用仍不清楚。研究人员假设，在幼年大鼠中，慢性间歇性低氧（CIH）通过三叉神经运动系统的神经可塑性变化，增强了睡眠期间与觉醒相关的咀嚼肌活动。将6周龄大鼠暴露于CIH（最低O₂为5%），在光照期每天6小时，持续1周。在7周龄时，进行免疫组织化学分析，以评估含有三叉神经前运动神经元的脑干区域中的FosB表达，以及三叉神经运动核中多巴胺-β-羟化酶阳性纤维的密度。在CIH暴露后的7周龄时，进行电生理记录，以分析睡眠-觉醒周期中咬肌和二腹肌的活动。CIH增加了含有三叉神经前运动神经元的多个脑干区域的FosB表达，并增强了三叉神经运动核背外侧和腹内侧区域的去甲肾上腺素能纤维密度。两组之间的睡眠结构、脑电图频谱功率和旷场行为保持不变。虽然咬肌活动在各警觉状态下保持稳定，但CIH选择性地增加了睡眠觉醒期间二腹肌的活动。在幼年大鼠中，1周CIH诱导了三叉神经回路的可塑性，并增强了与觉醒相关的张口肌反应性，而不改变整体睡眠结构。

**论文解读：1周慢性间歇性低氧对幼年大鼠睡眠期间咀嚼肌肌电活动的影响**

**研究背景与问题**

阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的睡眠相关呼吸障碍，其特征是睡眠期间上气道反复阻塞和间歇性低氧血症。OSA的病理生理学涉及多种因素，包括肥胖或颅面形态导致的上气道解剖学狭窄、上气道扩张肌功能受损以及觉醒阈值降低。这些机制导致反复的呼吸事件、间歇性低氧和微觉醒，进而引发睡眠碎片化、睡眠质量下降和交感神经活动增加。值得注意的是，OSA不仅影响成人，在儿童和青少年中也普遍存在，并与神经认知、行为和心血管代谢后果相关。

已有报道指出，成年OSA患者在睡眠期间表现出咀嚼肌活动增加。在伴有微觉醒的呼吸暂停终止时，患者常出现张口和闭口肌的激活，这有助于气道重新开放和下颌稳定。此外，咀嚼肌激活常独立于呼吸暂停发生。例如，睡眠磨牙症（SB），一种睡眠期间的重复性咀嚼肌活动，常紧随微觉醒出现，反映了三叉神经运动输出与觉醒相关的调节。尽管OSA被认为是SB的风险因素，但许多SB发作与呼吸暂停或低通气事件无关。新兴证据表明，SB和OSA可在包括儿童和青少年在内的广泛年龄段内共存，且睡眠-呼吸事件与咀嚼肌活动之间存在间接的时间关联。这些发现表明，从儿童期到成年期，咀嚼肌活动与呼吸暂停之间的弱时间耦合是一种普遍的病理生理现象，并提示存在独立于呼吸事件之外的机制，导致OSA患者睡眠期间咀嚼肌活动增加。

慢性间歇性低氧（CIH）是OSA的标志性特征，可诱导中枢神经系统中广泛的结构和功能可塑性。OSA患者的神经影像学研究显示，小脑、前额叶皮层和海马体出现灰质减少和白质改变，这很可能由低氧相关的氧化应激和炎症驱动。动物模型已证明，CIH可诱导皮层运动兴奋性增加、孤束核（NTS）和延髓腹外侧区活动增强，以及舌下神经核中去甲肾上腺素能神经末梢增加。这些发现表明，在CIH暴露后，呼吸运动回路和觉醒通路内存在强大的脑干和皮层可塑性。综合这些发现，CIH作为后效应诱导脑干可塑性，很可能增强三叉神经前运动及运动网络对觉醒相关输入的响应性，从而放大睡眠期间的咀嚼肌激活。因此，研究人员假设，CIH通过三叉神经运动系统的神经可塑性变化，增强了睡眠期间与觉醒相关的咀嚼肌活动。本项研究旨在通过生理学和电生理学分析，在神经和运动系统功能成熟、睡眠-觉醒组织和咀嚼控制稳定的幼年大鼠中，评估CIH的后效应。

**主要技术方法**

本研究使用了36只雄性Sprague-Dawley大鼠（120-200 g，购自日本静冈县日本SLC公司），在6周龄时随机分配至CIH组或对照组（Na?ve）。主要技术方法包括：1）CIH暴露模型：将大鼠置于密封丙烯酸箱中，在光照期前半段（5:00-11:00）每天6小时，通过交替充入氮气和压缩空气，使箱内氧浓度在5%至21%之间循环，每次循环6分钟，持续1周。2）免疫组织化学分析：为评估慢性神经激活，使用抗FosB抗体对脑干切片进行免疫组化染色，计数含有三叉神经前运动神经元的多个脑干区域中的FosB阳性细胞。为量化去甲肾上腺素能纤维，使用抗多巴胺-β-羟化酶（DBH）抗体进行免疫组化染色，测量三叉神经运动核背外侧（含咬肌运动神经元）和腹内侧（含二腹肌运动神经元）区域中DBH阳性纤维的占比。3）电生理记录：在CIH暴露后，对植入电极的大鼠进行24小时连续记录，采集脑电图（EEG）和肌电图（EMG）信号。通过分析软件进行睡眠分期（觉醒、非快速眼动睡眠（NREM）和快速眼动睡眠（REM）），并量化咬肌和二腹肌的肌电活动。此外，通过旷场测试评估大鼠的焦虑和应激行为。

**研究结果**

**1. 免疫组化**
* **FosB表达**：与对照组（Na?ve）相比，CIH组在多个含有三叉神经前运动神经元的脑干区域中，FosB阳性细胞数量显著增加。这些区域包括：中脑三叉神经核（Vmes）、内侧臂旁核（MPb）、外侧臂旁核（LPb）、三叉神经间区（Vint）、三叉神经上核（Vsup）、三叉神经主核（Vp）、三叉神经运动核内侧网状区（RmJO）、小细胞网状核（PCRt）、中间网状核（IRt）、三叉神经脊束核口部（SpO5）以及孤束核吻侧部（rostral NTS）和尾侧部（caudal NTS）。在补充实验中，将CIH暴露从1周延长至3周，上述区域的FosB表达未进一步增加。
* **DBH免疫染色**：CIH组在三叉神经运动核的背外侧区域（含咬肌运动神经元）和腹内侧区域（含二腹肌运动神经元）中，DBH阳性纤维的占比均显著高于Na?ve组。

**2. 旷场测试**
CIH组与Na?ve组在总移动距离、各区域移动距离及各区域停留时间上均无显著差异，表明CIH未引起焦虑或应激行为的改变。

**3. 睡眠变量**
在暗期，CIH组的REM睡眠时间显著长于Na?ve组，但觉醒和NREM睡眠时间无显著差异。在光期，两组间的觉醒、NREM和REM睡眠占比均无显著差异。此外，两个时期中，NREM和REM睡眠期间的觉醒频率在两组间均无显著差异。

**4. 脑电图（EEG）活动**
在NREM和REM睡眠期间，两组间的δ波和θ波功率占比在暗期和光期均无显著差异。

**5. 咀嚼肌肌电活动**
* **咬肌（闭口肌）**：在觉醒、NREM睡眠和REM睡眠期间，两组间的平均咬肌活动在暗期和光期均无显著差异。
* **二腹肌（张口肌）**：在暗期，两组间的平均二腹肌活动在各警觉状态下无显著差异。但在光期，CIH组在觉醒期间的二腹肌活动显著高于Na?ve组，而在NREM和REM睡眠期间无显著差异。

**6. 觉醒期间肌电活动**
* **咬肌**：在NREM和REM睡眠相关的觉醒期间，两组间的咬肌活动在暗期和光期均无显著差异。
* **二腹肌**：在暗期，CIH组在NREM睡眠相关的觉醒期间，二腹肌活动显著高于Na?ve组。在光期，CIH组在NREM和REM睡眠相关的觉醒期间，二腹肌活动均显著高于Na?ve组。

**结论与讨论**

本研究通过免疫组织化学和电生理学方法，探讨了1周CIH如何影响调节下颌运动的脑干回路并改变幼年大鼠的咀嚼肌活动。研究结论指出，CIH显著增加了含有三叉神经前运动神经元区域的FosB阳性细胞数量，并增加了三叉神经运动核背外侧和腹内侧区域中DBH阳性纤维的密度。睡眠结构、EEG功率谱和旷场行为未受影响。咬肌活动在各警觉状态下无差异，但CIH组在光期觉醒期间以及NREM和REM相关觉醒期间，二腹肌活动显著升高。这些发现表明，1周CIH诱导了参与下颌运动调节的脑干网络发生可塑性变化，并选择性地增强了与觉醒相关的张口肌激活，而不改变睡眠结构或行为。

讨论部分总结了CIH暴露参数的有效性，其参数（最低O₂ 5%，每天约60个循环，光照期暴露）属于严重且生理相关的范围，能够有效模拟OSA相关的CIH。FosB表达在含三叉神经前运动神经元的区域增加，反映了CIH引起的持续神经激活，可能源于呼吸-三叉神经通路中长时程易化（LTF）相关的兴奋性增强，以及氧化应激导致的神经元高兴奋性。三叉神经运动核中去甲肾上腺素能纤维密度的增加，可能反映了CIH诱导的、主要来自A7细胞群的去甲肾上腺素能投射的激活或出芽，从而增强三叉神经运动神经元的兴奋性。CIH对行为、睡眠结构和EEG的影响有限，表明观察到的咀嚼肌活动变化是CIH的后效应，而非睡眠碎片化所致。研究中，二腹肌活动在觉醒期和睡眠觉醒时选择性增加，而咬肌活动不变，这可能与两种肌肉运动神经元不同的抑制性输入有关：闭口肌运动神经元受到更强的抑制性控制，从而抑制了CIH相关的增强性输入。因此，研究结论为：CIH增加了觉醒期间张口肌通路的反应性，对幼年大鼠的张口肌和闭口肌产生不同的影响。该研究为理解OSA与睡眠磨牙症共存的机制提供了新的见解，即CIH诱导的神经可塑性可能促进SB发作，而独立于呼吸事件。