AP4B1同义变异体的剪接效应：多组学方法确诊两名痉挛性截瘫姐妹

《HUMAN MUTATION》：Splice effect of a synonymous variant in AP4B1: multiomics approach establishes the diagnosis in two sisters with spastic paraplegia

　　

疑似单基因疾病的患者在外显子组测序（exome sequencing）后常常仍未确诊。研究人员报告了一个家庭，其中两名姐妹患有复杂的痉挛性截瘫（spastic paraplegia）。最初的外显子组测序识别出在AP4S1和AP4B1（衔接蛋白复合物4（AP-4）的亚基）中存在单等位基因致病性无义变异，提示双基因遗传（digenic inheritance）。由于AP-4相关疾病尚未确立双基因遗传，研究人员应用了包括基因组测序（genome sequencing）、RNA测序（RNA sequencing）和蛋白质组学（proteomics）在内的多组学方法（multiomics approach）来阐明遗传原因。通过RNA测序，一个预测的同义变异（synonymous variant）（NM_006594.5:c.969G > A），与AP4B1中的无义变异构成复合杂合（compound heterozygous），并且之前被认为良性，被重新优先考虑，因为展示了异常剪接（aberrant splicing）。蛋白质组学显示AP-4组分AP4B1和AP4M1丰度降低，以及货物蛋白ATG9A上调，证实了AP-4缺乏。尽管AP4S1变异导致无义介导的衰变（nonsense-mediated decay），但在AP4B1中鉴定出双等位基因致病性变异确立了单基因“痉挛性截瘫47，常染色体隐性遗传”的诊断，而最初的双基因遗传假设被反驳。这项研究说明了多组学方法在罕见病诊断工作流程中的价值以及同义变异的致病潜力。

**论文解读：多组学方法揭示AP4B1同义变异的剪接效应并确诊痉挛性截瘫**

**研究背景与问题**
单基因疾病（monogenic disorders）的分子诊断常面临挑战，全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）的诊断率仍低于50%。遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia, HSP）是一组神经退行性疾病，临床分为单纯型和复杂型，后者可伴有癫痫、智力障碍等。衔接蛋白复合物4（adaptor protein complex 4, AP-4）由四个亚基（AP4B1、AP4M1、AP4E1、AP4S1）组成，介导货物蛋白（如ATG9A）从反式高尔基体网络向神经元末梢的囊泡运输；双等位基因功能丧失变异导致AP-4相关HSP（SPG47、SPG50、SPG51、SPG52），表现为儿童期发病的复杂型HSP。本研究中，两名姐妹患有复杂型痉挛性截瘫，初始WES检测到AP4S1和AP4B1中各有一个单等位基因致病性无义变异，提示可能存在双基因遗传（digenic inheritance），但AP-4相关疾病中双基因遗传尚未被证实。因此，需要应用多组学方法（multiomics approach）以明确遗传病因。

**研究内容与结论**
研究人员（Susann Badmann等）对一名37岁和一名27岁的患病姐妹及其健康父母进行了多组学分析，包括全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）、血液RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）和成纤维细胞蛋白质组学（proteomics）。结果发现，一个先前被归类为“可能良性”的同义变异（synonymous variant）AP4B1 c.969G>A（母源）在RNA-seq中证实了异常剪接，导致外显子6缺失222个核苷酸（框内缺失74个氨基酸）。蛋白质组学显示AP-4复合物组分（AP4B1、AP4M1）丰度降低，且货物蛋白ATG9A上调，证实AP-4功能缺陷。最终，两姐妹在AP4B1中携带双等位基因致病性变异（父源无义变异c.894T>A和母源同义变异c.969G>A），确诊为常染色体隐性遗传的痉挛性截瘫47型（SPG47），反驳了最初的双基因遗传假设。该研究发表于《HUMAN MUTATION》，强调了多组学方法在罕见病诊断中的价值，以及同义变异可能具有致病性。

**关键技术与方法**
研究人员采用以下主要技术方法（样本队列来源需注明）：
- **全基因组测序（WGS）**：对患者及父母外周血DNA进行Illumina NovaSeq6000测序（平均覆盖度>45×），比对至GRCh37（hg19）参考基因组。
- **RNA测序（RNA-seq）**：从患者及父母PAX血样中提取RNA，构建链特异性mRNA文库，在Illumina HiSeq6000平台进行100 bp双端测序；使用DROP17流程（含OUTRIDER检测异常表达，FRASER2检测异常剪接），对照队列为350份来自孟德尔疾病患者的血样转录组数据集。
- **蛋白质组学（proteomics）**：从患者及父母皮肤成纤维细胞（0.5×10⁶细胞）提取蛋白，经胰蛋白酶消化、TMT 11-plex标记后，进行碱性反相色谱分级分离，再用Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行数据依赖采集（data-dependent acquisition）和多阶MS3模式分析；蛋白质鉴定用MaxQuant v1.6.17.0，异常值检测用PROTRIDER（基于自编码器），对照队列为249份来自疑似孟德尔疾病个体的成纤维细胞蛋白质组数据集。

**研究结果**

**3.1 复杂型HSP的临床表现**
两名姐妹均表现为短身材、小头畸形、部分胼胝体发育不全、癫痫发作、进行性痉挛和认知障碍；大妹（37岁）从未独立行走，小妹（27岁）1岁时出现局灶性癫痫持续状态，13岁后自行缓解；脑MRI显示双侧颞额叶皮质和皮质下萎缩、脑室扩大等。症状相似且病程一致，提示常染色体隐性遗传。

**3.2 前期遗传诊断提示双基因遗传**
Array-CGH未见异常。Quattro-WES在两名姐妹中均检测到AP4S1（NM_001128126.3:c.124C>T，母源）和AP4B1（NM_006594.5:c.894T>A，父源）的单等位基因致病性无义变异，以及AP4B1的一个同义变异（c.969G>A，母源），后者按ACMG标准被归类为“可能良性”。由于两个基因编码AP-4亚基，研究人员提出双基因遗传假说。

**3.3 多组学诊断确立AP4B1相关HSP**
WGS确认了上述变异。SpliceAI预测同义变异c.969G>A会在下游2个核苷酸处形成新剪接受体位点（Δ评分=0.99）和上游221个核苷酸处形成新剪接供体位点（Δ评分=0.54）。RNA-seq证实该变异导致AP4B1外显子6中222个核苷酸丢失，形成框内缺失（p.(Gly250_Ser323del)）；AP4B1转录本水平在无义变异携带者中降低（虽未达统计学显著）。AP4S1变异引起无义介导的衰变（nonsense-mediated decay, NMD）。蛋白质组学分析显示，与249个对照相比，两名姐妹成纤维细胞中AP4B1（个体1: padj=0.026, fc=0.49）和AP4M1（个体1: padj=0.002, fc=0.46; 个体2: padj=0.0015, fc=0.47）丰度显著降低，AP4E1轻微降低（不显著），AP4S1在患者和部分对照中均未检测到；同时AP-4货物蛋白ATG9A丰度上调（个体1: padj=0.002, fc=1.7）。基于这些证据，同义变异c.969G>A被重新分类为“可能致病”（PM2_supporting, PM3, PM4, PP4），AP4B1双等位基因（可能）致病性变异确立了“痉挛性截瘫47，常染色体隐性遗传”（OMIM #614066）的诊断，双基因遗传假说被否定。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，WGS检测到大量变异，单个变异与临床表型相关的先验概率很低，因此变异解读易出错，整合转录组学与蛋白质组学等组学数据可提供功能证据，降低误判风险。同义变异通常被认为是良性的，但少数可影响剪接、翻译效率或mRNA稳定性，应纳入诊断评估。RNA-seq可验证计算机预测的剪接效应，将诊断率提升7.5%-36%。蛋白质组学不仅能检测致病基因本身的蛋白表达异常，还能揭示蛋白复合物及下游相互作用伙伴的变化，如本研究中AP-4亚基减少伴随ATG9A上调。AP-4缺乏导致ATG9A在反式高尔基体网络中的错误定位，该现象可用于开发替代标志物（“ATG9A比率”），但无法区分具体亚基，因此需要多组学互补。准确的亚型特异性分子诊断对基因治疗临床试验至关重要，AAV9介导的基因替代疗法对于AP4B1相关HSP（SPG47）已进入临床评估（I/II期试验，ClinicalTrials.gov ID NCT06948019）。

**研究结论翻译**：多组学方法使两名姐妹在多年不确定后获得了AP4B1相关HSP的诊断。早期诊断对患者及其家庭在情感和实际方面至关重要，有助于家庭规划和适当的临床管理，特别是由于基于AAV（腺相关病毒）的基因替代疗法目前正在临床评估中。虽然RNA测序越来越多地整合到诊断中，但蛋白质组学仍主要局限于研究环境。这项研究展示了将两种方法整合到诊断评估中以解决NGS（下一代测序）阴性病例并改善患者护理的价值。