线粒体tRNASer(AGY) 12234A?>?G突变可能促进肥厚型心肌病相关tRNAIle 4263A?>?G突变的临床表达

《HUMAN MUTATION》：Mitochondrial tRNASer(AGY) 12234A?>?G Mutation May Contribute to the Clinical Expression of Hypertrophic Cardiomyopathy-Associated tRNAIle 4263A?>?G Mutation

　　

线粒体tRNA（mt-tRNA）突变被发现与肥厚型心肌病（HCM）相关，但其分子机制仍大多未明确。在本研究中，研究人员调查了一个新的HCM相关mt-tRNASer(AGY) 12234A?>?G突变在两个遗传上无关的汉族家系中对mt-tRNAIle 4263A?>?G突变表型表达的贡献。引人注目的是，同时携带m.4263A?>?G和m.12234A?>?G突变的一个家系（HCM2）的外显率和表现度远高于仅携带m.4263A?>?G突变的另一个家系（HCM1）。在分子水平上，同质性m.4263A?>?G突变位于tRNAIle 5′-端前体的加工位点，破坏了一个保守的Watson–Crick碱基配对（1A–69T），该配对被认为会导致线粒体功能障碍。此外，异质性m.12234A?>?G突变发生在tRNASer(AGY)反密码子茎中一个极度保守的核苷酸上，该位置对tRNA结构和功能至关重要。利用转线粒体细胞模型，研究人员证明携带两种mt-tRNA突变的胞质杂合细胞（cybrids）比仅携带m.4263A?>?G突变的cybrids表现出更严重的线粒体功能障碍。此外，在同时携带m.4263A?>?G和m.12234A?>?G突变的细胞中观察到mt-RNA转录本的显著减少。综上所述，该研究表明m.12234A?>?G突变与m.4263A?>?G突变协同作用，引发线粒体功能障碍，并导致携带两种mtDNA突变的家系中HCM的高外显率。

**论文解读：线粒体tRNA协同突变与肥厚型心肌病表型表达的关系**

**研究背景与问题**
肥厚型心肌病（HCM）是一种遗传性心血管疾病，影响约1/500的个体，以左心室肥厚和舒张功能障碍为特征，是年轻个体心源性猝死的主要原因。虽然HCM主要由编码肌节蛋白的核基因突变（如MYH7、MYBPC3等）引起，但仍有相当比例病例的遗传病因未明。心脏高度依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）供能，而线粒体DNA（mtDNA）突变，尤其是线粒体tRNA（mt-tRNA）基因突变，已被报道与HCM相关，但其分子机制仍不明确。鉴于线粒体tRNA突变在HCM中的致病性尚存争议，且不同突变之间可能存在协同效应，有必要系统研究mt-tRNA突变对HCM表型表达的影响。

**研究内容与结论**
研究人员对来自中国杭州的421例HCM患者和589例对照进行mt-tRNA突变筛查，鉴定出两个汉族家系（HCM1和HCM2）携带母系遗传的同质性tRNAIle 4263A?>?G突变。有趣的是，HCM2家系还携带一个新型异质性tRNASer(AGY) 12234A?>?G突变，且该家系HCM的外显率和表现度显著高于仅携带m.4263A?>?G的HCM1家系。通过构建转线粒体细胞模型（cybrids），研究人员发现同时携带两种突变的cybrids比仅携带m.4263A?>?G突变的cybrids表现出更严重的线粒体功能障碍，包括ATP产量降低、线粒体膜电位（MMP）下降、活性氧（ROS）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）升高、NAD+/NADH比值降低、Ca²⁺超载、乳酸生成增加，以及mt-RNA转录本（ND1、ND2、ND3、ND5、A6、A8）显著减少。结合全外显子组测序（WES）排除核基因突变，研究证实m.12234A?>?G突变与m.4263A?>?G突变协同作用，加剧线粒体功能障碍，从而增强HCM的临床表达。该论文发表在《HUMAN MUTATION》。

**主要关键技术方法**
1. **样本队列来源**：来自杭州第一人民医院的421例HCM患者和589例健康对照（汉族）。
2. **全外显子组测序（WES）**：对家系成员进行WES，经公共数据库（1000 Genomes、gnomAD）和内部对照数据库（n=589）过滤，排查已知HCM相关核基因（MYH7、MYBPC3等）的罕见变异。
3. **mtDNA突变分析**：采用PCR-Sanger测序对母系亲属进行全线粒体基因组测序，与修订版剑桥参考序列（rCRS）比对，并利用Clustal W进行跨物种保守性评估，结合MITOMAP、mtDB、mtSNP数据库评估致病性。
4. **转线粒体细胞模型（cybrids）**：将患者及对照的血小板与143B ρ⁰细胞融合，构建携带不同mtDNA突变组合的cybrid细胞系，用于后续功能检测。
5. **线粒体功能检测**：包括ATP产量、MMP、ROS、NAD+/NADH比值、Ca²⁺水平、乳酸浓度、8-OHdG浓度及mt-RNA转录水平的定量分析（qPCR）。

**研究结果**
**3.1 临床发现**：HCM1家系先证者（II-6）为65岁女性，最大左心室壁厚度（MLVWT）22.4 mm，室间隔/左后壁厚度比（IVS/LPW）=1.81，心电图示心房颤动；另有两名受累亲属。HCM2家系为四代家系，11名母系亲属中6人患病，发病年龄33-60岁（平均48岁），先证者（III-11）MLVWT 14.8 mm，心电图示心房颤动和起搏，其母（II-6）MLVWT 15.6 mm，另一名亲属（II-8）MLVWT 14.5 mm。HCM2家系的外显率和疾病严重程度均高于HCM1家系。
**3.2 全外显子组测序分析**：WES未在两个家系任一受累成员中发现已知HCM相关核基因（MYH7、MYBPC3等）的罕见功能缺失突变，排除核基因为主因的可能。
**3.3 mtDNA突变评估**：两个家系均携带43个mtDNA突变，分别属于东亚单倍群D4j和D4。除m.4263A?>?G和m.12234A?>?G外，其余突变均不保守。m.4263A?>?G位于tRNAIle基因5′-端前体加工位点，破坏1A-69T碱基配对；m.12234A?>?G位于tRNASer(AGY)反密码子茎第42位，该位置高度保守，缺失于589例对照，提示其致病性。
**3.4 血浆8-OHdG水平升高**：与无突变对照相比，仅携带m.4263A?>?G突变者及同时携带两种突变者血浆8-OHdG水平均显著升高（p=0.006和p=0.002），提示氧化应激增加。
**3.5 mtDNA拷贝数减少**：仅携带m.4263A?>?G突变者mtDNA拷贝数为对照的76.5%（p=0.032），同时携带两种突变者降至48.1%（p=0.018）。
**3.6 胞质杂合细胞模型的建立**：成功将患者和对照的血小板与143B ρ⁰细胞融合，经Sanger测序确认cybrids携带相应mtDNA突变。
**3.7 ATP产量降低**：仅携带m.4263A?>?G突变者cybrids ATP产量为对照的73.6%（p=0.021），同时携带两种突变者降至51.2%（p=0.019）。
**3.8 线粒体膜电位（MMP）改变**：同时携带两种突变者MMP为对照的46.3%（p=0.015），仅携带m.4263A?>?G突变者为71.5%（p=0.025）。
**3.9 ROS产生增加**：同时携带两种突变者ROS为对照的161.7%（p=0.002），仅携带m.4263A?>?G突变者为143.2%（p=0.032）。
**3.10 NAD+/NADH比值分析**：同时携带两种突变者NAD+/NADH比值为对照的42.8%（p=0.005），仅携带m.4263A?>?G突变者为63.3%（p=0.033）。
**3.11 Ca²⁺超载**：同时携带两种突变者Ca²⁺水平显著升高（p=0.0017），仅携带m.4263A?>?G突变者也升高（p=0.042）。
**3.12 细胞外乳酸生成增加**：同时携带两种突变者乳酸为对照的195.2%（p=0.008），仅携带m.4263A?>?G突变者为171.4%（p=0.034）。
**3.13 m.12234A?>?G突变阻断mt-RNA转录**：qPCR显示，同时携带两种突变者cybrids中MT-ND1、ND2、ND3、ND5、A6、A8 mRNA水平显著低于仅携带m.4263A?>?G突变者及对照，提示m.12234A?>?G突变至少部分抑制mt-RNA转录。

**讨论与结论**
讨论部分指出，HCM家系中母系传递模式提示线粒体功能障碍是重要分子基础。m.4263A?>?G突变位于tRNAIle 5′-端加工位点，改变ND1 mRNA终止密码子并破坏碱基配对，此前研究已证实其导致tRNAIle稳态水平降低和线粒体蛋白合成缺陷。m.12234A?>?G突变位于tRNASer(AGY)反密码子茎第42位，该位置在tRNAIle（m.4300A?>?G）和tRNAThr（m.15927G?>?A）中均为致病突变，且tRNASer(AGY)缺乏D环和D茎结构，反密码子茎突变更易影响其生物活性。两种突变共同导致mt-RNA翻译缺陷，引起多个OXPHOS复合物功能不足，表现为ATP、MMP、NAD+/NADH比值降低，而ROS、8-OHdG、Ca²⁺、乳酸升高，氧化应激加剧和能量代谢紊乱共同促进HCM表型。

**研究结论**：该研究证明了一个新的HCM相关等位基因（tRNASer(AGY) 12234A?>?G突变）在HCM相关tRNAIle 4263A?>?G突变临床表达中的作用。m.12234A?>?G突变改变了tRNASer(AGY)的结构和功能，加剧了线粒体功能障碍，提高了由m.4263A?>?G突变引起的HCM外显率。因此，该研究为mt-tRNA突变导致HCM的病理生理学提供了新的见解。