《Pharmacological Research》：A universal cell-based method for high-throughput analysis of viroporin function and inhibition
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病毒孔蛋白（viroporin）是一类主要由RNA病毒编码的跨膜蛋白，它们寡聚化形成对病毒生命周期多个阶段至关重要的孔道。尽管病毒孔蛋白是有吸引力的抗病毒药物靶点，但相关进展部分受到缺乏评估病毒孔蛋白活性与抑制的高通量方法的限制。在此，研究人员提出了一种新型基
病毒孔蛋白（viroporin）是一类主要由RNA病毒编码的跨膜蛋白，它们寡聚化形成对病毒生命周期多个阶段至关重要的孔道。尽管病毒孔蛋白是有吸引力的抗病毒药物靶点，但相关进展部分受到缺乏评估病毒孔蛋白活性与抑制的高通量方法的限制。在此，研究人员提出了一种新型基于细胞的荧光驱动方法（VipoFluX），该方法能够在真核细胞中高通量发现病毒孔蛋白并对其进行表征，包括抑制研究。研究人员通过复现既有检测方法的数据集，并证明其可适用于多种不同病毒孔蛋白，确认了该方法的稳健性。利用该平台，研究人员针对四个靶点（甲型流感病毒M2蛋白、严重急性呼吸综合征病毒2型E蛋白、柯萨奇病毒B3的2B蛋白、人免疫缺陷病毒1型的vpu蛋白）筛选了病毒孔蛋白抑制剂，并使用双电极电压钳电生理学对命中化合物进行了验证。总体而言，该方法为推进病毒孔蛋白研究和加速抗病毒药物发现提供了可扩展且多功能的工具。
病毒孔蛋白（viroporin）是一类由RNA病毒编码的跨膜蛋白，通过寡聚化形成通透离子和小分子的孔道，在病毒入侵、复制和释放等环节发挥重要作用，因此被视为有潜力的抗病毒药物靶点。然而，现有病毒孔蛋白功能研究方法多依赖纯化或合成蛋白在脂质体系中的重构，存在产量低、成本高、标签干扰、仅包含部分结构域等缺陷；电生理学方法通量低且难以平行化，导致抑制剂筛选十分耗时。针对这些问题，研究人员开发了一种基于细胞的荧光驱动高通量方法VipoFluX，并发表于《Pharmacological Research》。
研究人员将荧光素二乙酸酯（FDA）加载到人胚胎肾293T（HEK293T）细胞中，FDA经胞内酯酶水解为荧光素，若细胞膜表达功能性病毒孔蛋白，荧光素可经孔道释放到胞外，通过比较加药前后荧光强度计算释放比例。以此原理，研究人员在384孔板中建立了VipoFluX流程，并用甲型流感病毒M2蛋白（M2IAV）进行概念验证。结果显示，表达M2IAV的细胞荧光素释放显著升高，已知无功能突变V27F释放降低，药物敏感突变V27A对金刚烷胺和金刚乙胺产生抗性；M2IAV的pH敏感性也得到重现。此外，研究人员还测试了来自多种病毒科的另外六种病毒孔蛋白，除腮腺炎病毒SH蛋白（SHMuV）外，均检测到功能；引入已知或设计的功能缺失突变后，荧光素释放显著减少。接下来，研究人员利用5种已知病毒孔蛋白抑制剂进行处理，发现每种被测病毒孔蛋白至少能被其中一种化合物抑制，且与既往文献一致。为扩大适用范围，研究人员利用HiBiT标签系统构建代理抑制策略，发现LgBiT蛋白和抗HiBiT抗体可分别抑制特定标记病毒孔蛋白的功能。随后，研究人员用VipoFluX筛选了含有1139种已知离子通道抑制剂的小分子库，针对M2IAV、ESARS-CoV-2、2BCVB3和vpuHIV-1四个靶点筛选出先导化合物，并通过双电极电压钳（TEVC）在爪蟾卵母细胞上验证了这些化合物的抑制效果，阳性对照化合物也产生类似抑制，证实了VipoFluX筛选结果的可靠性。
在技术方法上，该研究主要使用了VipoFluX荧光释放功能分析、Nano-Glo HiBiT细胞表面表达检测、化合物库筛选和双电极电压钳（TEVC）四种核心技术。样本来源包括HEK293T细胞（ATCC CRL-3216）和用于电生理验证的爪蟾卵母细胞（购自Ecocyte Bioscieence）。研究者在384孔板上进行转染和荧光检测，并将筛选出的先导化合物在卵母细胞上通过TEVC记录电流变化。
在结果方面，按原文小标题分述如下：
（一）VipoFluX方法的设计。该部分阐述了FDA进入细胞被水解为荧光素的原理，以及通过两次荧光测量计算释放率的流程。
（二）VipoFluX概念验证。包括M2IAV的实验确认，以及从不同病毒科选取的多种病毒孔蛋白的功能表征。其中，M2IAV、ESARS-CoV-2、2BCVB3、vpuHIV-1和6kCHIKV均显示出显著荧光素释放，且突变体功能降低；p7HCV表达较低，SHMuV未检测到显著释放。
（三）小分子抑制病毒孔蛋白功能。使用金刚烷胺、BIT225、HMA、金刚乙胺和氧杂蒽等化合物处理，发现至少一种化合物可抑制每种被测病毒孔蛋白；氧杂蒽抑制所有被测病毒孔蛋白，且不能排除其通过膜扰动发挥作用；HMA的脱靶效应和细胞毒性也被观察到。
（四）病毒孔蛋白的代理抑制。HiBiT标记的病毒孔蛋白可被LgBiT或抗HiBiT抗体抑制，其中LgBiT仅对6kCHIKV有效，抗HiBiT抗体对M2IAV、ESARS-CoV-2和6kCHIKV有效。
（五）病毒孔蛋白抑制剂筛选。筛选1139种化合物后，每个靶点均获得了浓度反应明确的先导化合物。
（六）命中化合物的交叉验证。TEVC实验证实，氟乙基去甲金刚烷胺抑制M2IAV，PF-05241328抑制ESARS-CoV-2，阿米洛利盐酸盐二水合物抑制2BCVB3，GSK2798745抑制vpuHIV-1，与VipoFluX结果一致。
讨论部分强调，VipoFluX可作为可靠工具用于病毒孔蛋白功能表征和抑制剂筛选。其优势在于无需纯化蛋白、可在人细胞系中进行、成本较低、通量高。但该方法也存在局限，如不能检测自发荧光化合物、部分病毒孔蛋白（如p7HCV和SHMuV）释放信号不足。此外，研究还提示即使小标签如HiBiT也可能改变病毒孔蛋白药物敏感性和功能，而VipoFluX可使用无标签蛋白，保留完整蛋白，更适合研究真实功能。研究人员认为，VipoFluX的规模化应用有望扩大病毒孔蛋白抑制剂筛选规模，并推动以病毒孔蛋白为靶点的药物开发。
研究结论：研究人员成功开发并验证了一种基于细胞的荧光高通量方法VipoFluX，可广泛用于病毒孔蛋白的功能表征和抑制剂发现。通过从1139种化合物中筛选并经电生理学验证，该方法能够鉴定新的病毒孔蛋白-抑制剂配对，未来有望应用于更大的化合物库并加速抗病毒药物研发。
