《Process Biochemistry》：Metabolic pathway engineering and substrate channeling for enhancing
N-acetylneuraminic acid biosynthesis in
Escherichia coli
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摘要N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）具有多种生理功效，包括抗病毒、抗氧化作用以及免疫调节功能。由于在基础研究以及药品、化妆品和食品等商业应用中都有巨大需求，因此开发一种绿色、高效且低成本的Neu5Ac生物合成途径具有重要意义。在本研究中，我们通过构建并优化由特定自组装肽对介导的多
摘要
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）具有多种生理功效，包括抗病毒、抗氧化作用以及免疫调节功能。由于在基础研究以及药品、化妆品和食品等商业应用中都有巨大需求，因此开发一种绿色、高效且低成本的Neu5Ac生物合成途径具有重要意义。在本研究中，我们通过构建并优化由特定自组装肽对介导的多酶复合物，设计了一种用于高效合成Neu5Ac的大肠杆菌平台。这种基于RIDD-RIAD的组装结构提升了连续反应路径的催化效率，从而增加了代谢通量与产物产量。此外，该方案还增强了关键前体UDP-GlcNAc的内源生物合成途径，进一步大幅提高了Neu5Ac的产量。通过在5升生物反应器中进行放大培养，该菌株的Neu5Ac浓度达到了74.116克/升，生产速率则为1.370克/升/小时。Neu5Ac生物产量的显著提升表明，构建合成多酶复合物作为一种实用有效的策略，在空间上组织代谢途径方面具有巨大潜力，可为合成生物学中的高级底盘设计提供范例。
引言
N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是唾液酸家族中最主要的成员，广泛存在于人类、其他哺乳动物以及某些脊椎动物（如某些鱼类）的细胞表面糖脂和糖蛋白中。在这些生物体内，它发挥着重要的生理和病理作用，包括介导细胞间通讯与识别，以及调节细胞免疫和炎症反应[1]、[2]、[3]。Neu5Ac还具有多种生理益处，包括抗病毒、抗氧化作用，可调节免疫功能，还能促进大脑发育和认知功能[4]。值得注意的是，Neu5Ac是人类乳汁低聚糖中的核心成分，而这些低聚糖对婴儿的发育起着至关重要的作用[5]、[6]、[7]。美国食品药品监督管理局、欧洲食品安全局以及中国政府部门均已批准Neu5Ac作为新型食品添加剂。鉴于在生理功能研究以及药品、化妆品和食品工业等商业应用领域对Neu5Ac的巨大需求，开发一种绿色、高效且低成本的合成方法显得尤为重要。
传统上，Neu5Ac主要通过天然提取（如从古比洛糖或酪蛋白中提取）以及化学/酶法合成获得[8]、[9]、[10]。然而，天然提取受原材料成本高且供应有限的限制。而化学或酶化化学合成则往往需要苛刻的反应条件，还会使用昂贵且有毒的金属催化剂，从而导致高昂的生产成本和环境污染[4]。此外，用于Neu5Ac生产的整体细胞催化法需要以N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和丙酮酸作为底物，这不仅增加了生产成本，还使得下游产品的分离和纯化变得更为复杂。这些局限性凸显出需要开发绿色、高效且经济的替代生产途径。利用经过代谢工程改造的微生物细胞工厂进行发酵，因其条件温和、采用绿色催化方式、原料可再生且对环境友好，已成为Neu5Ac合成中最具前景的方法[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。
为在微生物中合成Neu5Ac，通常需要引入异源代谢途径来生成关键前体N-乙酰甘露糖胺（ManNAc），主要有两种途径：AGE途径和NeuC途径[6]、[7]、[16]。前者是将外源基因AGE（编码酶N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶）引入宿主生物体，从而将GlcNAc转化为ManNAc；后者则是表达基因neuC（编码酶UDP-GlcNAc差向异构酶），将内源糖核苷酸UDP-GlcNAc转化为ManNAc。随后，引入编码酶N-乙酰神经胺酸合成酶的neuB基因，便可以利用磷酸烯醇式丙酮酸作为前体，将ManNAc转化为目标产物Neu5Ac。近年来，人们采用了多种合成生物学和蛋白质工程策略来提高微生物合成Neu5Ac的效率。例如，赵等人将外源基因neuC和neuB引入大肠杆菌中，同时敲除了多个与非目标代谢中间体消耗相关的基因。通过增强负责合成前体UDP-GlcNAc的内源基因glmS、glmM和glmU的表达，并精细调控路径中关键酶的表达水平，他们最终获得了46.92克/升的Neu5Ac产量[15]。最近，齐等人则利用对Neu5Ac有响应的生物传感器，结合多基因表达文库，通过流式细胞术对最佳路径酶表达水平进行了高通量筛选[18]。还有另一项最新研究通过基于人工智能的酶筛选、平衡前体比例（PEP和ManNAc），以及同时利用葡萄糖和甘油，对大肠杆菌菌株进行了优化[16]。
尽管已有各种代谢工程策略助力Neu5Ac的微生物生产，但仍有两个关键因素对提升其合成效率不可或缺。首先，合成路径涉及多种异源关键酶（即AGE、NeuC和NeuB）[11]、[13]、[19]。这些酶来自不同物种，其在宿主大肠杆菌中的催化速率和表达水平往往存在差异。因此，必须对这些酶进行选择和调控，才能获得高产菌株[16]。其次，微生物合成Neu5Ac需要多种代谢前体（即PEP和UDP-GlcNAc）的均衡供应，而这些前体的生成与核心碳代谢密切相关[11]、[12]、[17]。因此，合理调控内源基因的表达并合理分配碳代谢通量，对于前体及目标产物的合成都至关重要。所以，平衡细胞内的前体供应对于提高Neu5Ac的产量极为重要。
目前大多数研究主要集中于筛选Neu5Ac合成路径中的酶，并优化上下游酶的表达水平。另一个重要但常被忽视的因素是多酶级联反应的整体转化效率，而这取决于中间代谢物的快速转化。为路径酶引入空间组织策略，可进一步提升级联反应效率与产物生物合成效率[20]、[21]、[22]。在自然系统和合成系统中，多酶复合物中存在底物通道效应的现象已有充分记载[20]、[25]。这些研究表明，减少中间代谢物的扩散距离以及防止竞争性反应，是酶复合物提升通量的主要机制。例如，通过相互作用的肽对将路径酶组装成多酶复合物，可以加快中间代谢物的催化转化速度，减少代谢物扩散，降低有毒中间代谢物的积累，同时减轻代谢物带来的负反馈抑制作用[23]、[24]、[25]。目前已有多种蛋白质相互作用对，如SpyTag-SpyCatcher、SnoopTag-SnoopCather以及PDZlig-PDZ，被证实能够介导多酶复合物的组装[23]。另外，RIDD-RIAD这对相互作用标签也是一组理想且被广泛使用的标签，它具有多项独特优势。首先，它们分别是仅含44个和18个氨基酸的短肽，因此不会对目标酶的结构和活性造成任何潜在干扰。其次，它们的结合亲和力很高。第三，RIAD肽能特异性地与RIDD二聚体结合，形成1:2的化学计量比，进而有助于形成分支结构[22]。
本研究探讨了将关键路径酶进行空间组织，以及调控核心碳代谢作为综合代谢工程策略，以此提升大肠杆菌中Neu5Ac的生物合成效率。首先，通过来自不同来源的neuC和neuB基因的异源表达，构建了一条全新的合成路径，从而实现Neu5Ac的生产。随后，利用经典的蛋白质-蛋白质相互作用对RIDD–RIAD，促使NeuC和NeuB自我组装成酶复合物，进而加快催化转化速度，增强指向产物的代谢通量。为了进一步优化酶复合物的结构，系统地调整了相互作用基序的化学计量比。与此同时，通过调控内源酶GlmS、GlmM和GlmU的表达水平，提高了关键前体UDP-GlcNAc的供应量，这些因素共同促使Neu5Ac的产量显著上升。最后，将最优化的重组菌株在5升生物反应器中以葡萄糖作为唯一碳源进行分批补料发酵，最终获得了74.116克/升的Neu5Ac浓度，生产速率为1.370克/升/小时。
章节节选
试剂、菌株和质粒
细菌培养基的制备所用胰蛋白胨和酵母提取物购自位于美国密歇根州底特律的Difco Laboratories公司。此外，β-D-1-硫代半乳糖吡喃苷异丙基衍生物（IPTG）、抗生素以及其他分析级化学品则购自同样位于中国上海的Sangon Biotech Co., Ltd.公司。标准Neu5Ac则购自中国上海的上海华熙生物科技有限公司。有关化学物质的详细信息详见
在大肠杆菌中构建Neu5Ac全新生物合成路径并筛选关键路径酶
本研究选择大肠杆菌 BL21(DE3)菌株作为Neu5Ac生物合成的宿主。在赵等人之前的研究[15]中，已经有一种经过基因改造的大肠杆菌菌株被构建出来，能够以甘油作为唯一碳源来生产Neu5Ac。为了将碳流导向目标产物，本研究删除了多个与副产物生成以及中间产物或最终产物降解相关的内源基因，其中包括nanA基因（Neu5Ac醛缩酶，能够水解
结论
总之，通过利用特定的自相互作用肽对构建并优化多酶复合物，我们成功构建了一种可用于高效合成Neu5Ac的重组大肠杆菌 BL21(DE3)菌株。由RIDD-RIAD相互作用基序构成的合成多酶复合物，提升了连续反应路径的催化效率，进而增强了代谢通量，提高了产物产量。此外，该方案还强化了
CRediT作者贡献说明
乔丽平：正式分析。 倪大为：方法学。 林倩：写作——审阅与编辑。 盛绵：写作——审阅与编辑。 万莉：写作——审阅与编辑，正式分析。 刘元林：写作——初稿撰写，研究工作，正式分析。 穆万猛：监督，项目管理，概念构思。 张文利：研究工作，数据整理。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（编号2024YFF1106300）、济南市“重点项目征集制”下的科技计划（编号2024280560），以及江南大学食品科学资源国家重点实验室的研究计划（编号SKLF-ZZA-202501和SKLF-ZZB-202501）的支持。
刘元林|万莉|盛绵|林倩|倪大为|乔丽平|张文利|穆万猛
中国江苏省无锡市江南大学食品科学与技术学院食品科学资源国家重点实验室，邮编214122
