开发了一种高通量检测方法，用于识别能够抑制HAX1与CLPB相互作用的化合物

《Results in Chemistry》：Development of a high-throughput assay format to identify inhibitors of HAX1–CLPB interaction

　　

HAX1–CLPB蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）对于维持线粒体蛋白稳态（mitochondrial proteostasis）至关重要。由于该重要轴的扰动与髓系祖细胞过早死亡和严重先天性中性粒细胞减少症（severe congenital neutropenia）相关，研究人员假设靶向HAX1-CLPB可能在髓系恶性肿瘤中具有治疗价值。在此，研究人员建立了一个基于荧光偏振（fluorescence polarization, FP）的高通量筛选（high-throughput screening, HTS）平台，以鉴定HAX1–CLPB抑制剂。对40,640种化合物的初步筛选产生了112个初始阳性化合物，其中之一为Z16519514（N-methyl-2-(7-thia-9,11-diazatricyclo[6.4.0.0^2,6]dodeca-1(12), 2(6),8,10-tetraen-12-yloxy)acetamide）。使用微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）竞争实验进行的正交验证确认了该PPI抑制剂，而配体观察核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）波谱和表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）证实了其在CLPB上的靶点结合。这项工作提供了首个经生化验证的HAX1–CLPB相互作用小分子抑制剂，为开发靶向线粒体蛋白稳态和癌症细胞死亡的更有效、更具细胞活性的调节剂奠定了基础。

### 论文解读：开发高通量检测方法鉴定HAX1–CLPB相互作用抑制剂

#### 研究背景

HAX1（HS1-associated protein X-1）是一种主要定位于线粒体和内质网的多功能蛋白，参与调控线粒体蛋白稳态（mitochondrial proteostasis）、凋亡抑制、钙稳态和细胞骨架动力学等关键细胞过程。HAX1的功能缺失突变通过破坏线粒体膜电位并加速中性粒细胞凋亡，导致严重先天性中性粒细胞减少症（severe congenital neutropenia, SCN）。此外，HAX1在实体瘤和血液系统癌症中表达失调，凸显其作为治疗靶点的潜在价值。CLPB（Caseinolytic Mitochondrial Matrix Peptidase Proteolytic Subunit B）是一种AAA+ ATP酶伴侣蛋白，核心功能是解决线粒体内的聚集蛋白。HAX1与CLPB物理相互作用，形成功能复合体，共同维持线粒体蛋白稳态。CLPB突变（如p.Thr268Met、p.Tyr272Cys）导致3-甲基戊烯二酸尿症（3-methylglutaconic aciduria, MGCA7），该疾病在造血系统表型上与SCN部分重叠，提示共同的致病机制。尽管这一相互作用轴的重要性已被认识，但HAX1–CLPB结合的结构决定因素及破坏该复合体的功能后果仍不明确。因此，开发针对该蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）的化学探针，有望为关键依赖线粒体蛋白稳态的细胞（尤其是血液恶性肿瘤）提供新的治疗策略。

#### 研究目的

本研究旨在建立并验证一个基于荧光偏振（fluorescence polarization, FP）的高通量筛选（high-throughput screening, HTS）平台，以鉴定能够破坏HAX1–CLPB相互作用的先导小分子抑制剂，并利用多正交生物物理方法验证其靶点结合活性，为后续开发更有效的细胞活性调节剂奠定基础。

#### 主要技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：
1. **荧光偏振（FP）高通量筛选（HTS）**：利用末端标记Cy5的HAX1衍生物肽段（Cy5-HAX1_122-143）与重组人CLPB蛋白（CLPB_127-677）结合后产生的高偏振信号，建立竞争性FP检测体系，用于大规模筛选化合物库（Proteros 41k库，来源为Enamine）。
2. **微量热泳动（MST）**：以NHS荧光标记的CLPB蛋白与未标记的HAX1蛋白（70-201）形成复合物，建立竞争性MST检测方法，对FP筛选出的阳性化合物进行正交验证，确认其对HAX1–CLPB相互作用的抑制活性。
3. **核磁共振（NMR）波谱**：采用饱和转移差（STD）和T₂滤波¹H NMR实验，直接检测化合物与CLPB蛋白的瞬时结合相互作用，排除假阳性。
4. **表面等离子体共振（SPR）**：利用生物素化并固定在传感器芯片上的CLPBANK结构域（CLPB_128-297），进行多循环动力学分析，定量测定化合物与CLPB的平衡解离常数（K_d）。

#### 研究结果

**2.1. 荧光偏振实验能够实现HAX1–CLPB PPI的高通量筛选**
研究人员建立了基于FP的HTS检测方法，并进行了优化。通过滴定实验，确定Cy5-HAX1_122-143肽段与CLPB_127-677的结合K_d为55.1 nM，且AMP-PNP对其无显著影响。竞争性置换实验表明，不同长度的未标记HAX1蛋白（HAX1_70-201、HAX1_123-279、HAX1_123-201）均能有效竞争置换Cy5-肽段，而阴性对照α-酪蛋白（alpha-casein）无效，证明了检测的特异性。在384孔板中进行的机器人适应性验证显示，该检测方法具有优异的统计学参数：Z'因子≥0.5，板内%CoV为4.9%，板间%CoV为7.9%，均优于HTS标准阈值，验证了其适用于大规模筛选。

**2.2. 通过高通量荧光偏振实验鉴定阳性化合物**
基于验证的FP筛选平台，研究人员对40,640种化合物进行了单剂量（58.8 μM）筛选。全部筛选板的累积Z'因子≥0.5，表明信号背景比高、变异性低。单剂量筛选共获得112个初始阳性化合物（抑制率>25%），随后对这些化合物进行剂量依赖性验证，最终确认45个FP阳性的化合物（抑制率>50% at 588 μM，阳性率0.1%）。

**2.3. 通过MST、NMR和SPR验证FP实验的阳性化合物**
研究人员首先建立了MST直接结合实验，验证了未标记的HAX1野生型蛋白（70-201和123-279）与标记CLPB的结合K_d分别为1.4 μM和0.32 μM，而结合缺陷的HAX1 L130R突变体则显示非常弱的结合，确认了MST检测的有效性。进而建立的MST竞争置换实验表明，8个FP阳性化合物能够在微摩尔浓度范围有效置换HAX1蛋白与CLPB的结合，其中三个代表性化合物（Z16519514、Z1732206305、Z1767901013）的IC₅₀值在MST实验中得到确定。随后，配体观察的NMR实验（STD和T₂滤波）进一步证实了这三个化合物均能与CLPB发生瞬时相互作用。最后，SPR实验（使用CLPB_128-297 ANK结构域）定量分析了化合物Z16519514与CLPB的直接结合，测得其K_d为182 μM，而Z1732206305因干扰无法分析。综合这些正交验证方法，确认了化合物Z16519514是直接结合CLPB并破坏HAX1–CLPB相互作用的抑制剂。

**2.4. Z16519514衍生物的结构-活性关系**
研究人员对Z16519514进行了类似物寻找，以探究其药效团和结构-活性关系（SAR）。通过FP实验评估了49个商业可及的类似物（包括核心骨架替换、侧链修饰等），发现仅有2个结构非常相似的类似物保留了FP活性，其余化合物均显示出非常陡峭的SAR，即即使是微小的修饰也会导致活性丧失。这表明Z16519514可能嵌入了一个结构紧凑、空间和静电约束严格的CLPB结合口袋中。

#### 讨论与结论

讨论部分指出，本研究在生化实验中揭示了首个HAX1–CLPB蛋白-蛋白相互作用的小分子抑制剂，证明该相互作用轴是化学可干预的。尽管化合物Z16519514的活性中等（FP IC₅₀为123 μM，SPR K_d为182 μM），且SAR陡峭，但其“规则”的化学骨架通过了泛分析干扰化合物（PAINS）过滤器的评估，排除了非特异性干扰机制。研究人员认为，Z16519514的细胞活性评价因低亲和力而受限，其目前仅作为体外生化探针，其价值在于为后续药物化学优化提供了结构起点，类似于其他PPI靶点（如BCL-2家族、MDM2-p53）早期发现的弱活性抑制剂。通过进一步的迭代优化，有望开发出更有效、更具选择性的HAX1–CLPB抑制剂，用于探索该轴在维持线粒体蛋白稳态、特别是在造血谱系和肿瘤中的功能。

**研究结论（翻译原文）**：综上所述，我们建立了一个针对HAX1–CLPB相互作用的HTS平台，并在生化实验中鉴定出化合物Z16519514作为该相互作用的初始小分子筛选阳性化合物。生物物理数据证实了其对CLPB的直接结合，而MST实验确认了其破坏HAX1–CLPB相互作用的能力。尽管活性中等，但Z16519514在进一步优化后，可能为探索一个在生物学和临床上重要的线粒体蛋白稳态调控轴提供早期的结构起点，并可能为开发更有效、选择性的HAX1–CLPB抑制剂奠定基础。

该研究发表在《Results in Chemistry》。