通过LDHB进行代谢重编程赋予hiPSC来源的NK细胞对乳酸诱导的功能障碍的抵抗力和增强的抗肿瘤活性

《Stem Cell Reports》：Metabolic reprogramming via LDHB confers resistance to lactate-induced dysfunction and enhanced antitumor activity in hiPSC-Derived NK cells

　　

自然杀伤（NK）细胞通常在肿瘤微环境（TME）中表现出功能障碍，显著限制了其在抗肿瘤治疗中的疗效。肿瘤细胞表现出增强的糖酵解，导致乳酸（LA）分泌并在TME中积累。使用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的NK细胞（iNKs）作为模型，研究人员证明LA诱导显著的iNK功能障碍，包括存活率降低、IFN-γ分泌受损以及因线粒体功能严重受损而导致的肿瘤杀伤能力下降。为克服LA诱导的功能障碍，研究人员将乳酸脱氢酶B（LDHB）的表达盒敲入hiPSCs（LDHB-hiPSCs），从而使细胞内的乳酸转化为丙酮酸。从LDHB-hiPSCs衍生的iNKs（LDHB-iNKs）在很大程度上抵抗了LA诱导的功能障碍，在高LA肿瘤组织中表现出增强的细胞毒性和改善的存活率。重要的是，LDHB-iNKs在体内显示出对实体瘤形成的优越抑制能力。研究人员的这项研究通过重塑代谢途径，为增强针对实体瘤的NK细胞疗法提供了一种新策略。

**论文解读：通过LDHB代谢重编程增强hiPSC来源NK细胞抗实体瘤功能**

**研究背景与问题**

实体瘤微环境（TME）中，肿瘤细胞因Warburg效应增强糖酵解，导致乳酸（LA）大量积累，形成免疫抑制环境。自然杀伤（NK）细胞在TME中常出现功能障碍，表现为存活率降低、细胞因子分泌减少及肿瘤杀伤能力下降，严重限制其抗实体瘤疗效。尽管同种异体NK细胞疗法在血液恶性肿瘤中已显示潜力，但对实体瘤效果有限，关键原因之一是LA对NK细胞线粒体功能的损伤。目前，LA如何影响NK细胞的具体机制尚不充分，且缺乏有效策略来克服这种LA诱导的免疫抑制。为此，研究人员开展本研究，旨在通过代谢工程改造NK细胞，使其在LA富集的TME中维持功能，从而提升抗实体瘤能力。该研究发表于《Stem Cell Reports》。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：首先，利用CRISPR-Cas9辅助的同源重组技术，将乳酸脱氢酶B（LDHB）表达盒敲入人诱导多能干细胞（hiPSCs）的ROSA26安全港位点，构建LDHB-hiPSCs；其次，通过分步单层分化方案，将LDHB-hiPSCs依次分化为多能造血干/祖细胞（iHSPCs）和成熟NK细胞（iNKs），并使用OP9-DL1共培养和K562人工抗原呈递细胞（APCs）进行扩增和成熟；此外，运用流式细胞术、透射电镜（TEM）、Seahorse代谢分析、JC-1线粒体膜电位检测、ATP及NAD⁺/NADH比值测定等手段评估线粒体功能；最后，通过体内U87胶质瘤异种移植模型（NCG免疫缺陷小鼠，雌性，6-8周龄）评估LDHB-iNKs的肿瘤存活和抑瘤效果。样本队列来源：hiPSCs（RS004）和肿瘤细胞系（U87-MG、SKOV3）均来自华南干细胞库。

**研究结果**

**LA诱导iNK细胞功能障碍**：通过PMA/离子霉素刺激及重复杀伤实验，研究人员发现15 mM LA处理显著降低iNK细胞的CD107a脱颗粒能力、IFN-γ分泌及对U87和SKOV3肿瘤细胞的杀伤活性，尤其在低效应靶比（E:T）和第二次杀伤中更为明显，表明LA严重损害iNK效应功能。

**LA损害iNK细胞线粒体功能**：透射电镜和TOMM20免疫染色显示，LA处理导致iNK线粒体数量减少、体积变小；JC-1染色显示线粒体膜电位显著去极化；Seahorse分析表明氧气消耗速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR）均下降；ATP产量和NAD⁺/NADH比值也降低，证明LA通过损伤线粒体功能诱导iNK功能障碍。

**通过基因靶向生成LDHB表达hiPSCs**：RT-qPCR显示iNK细胞中LDHB表达低于LDHA。研究人员利用CRISPR-Cas9在hiPSCs的ROSA26位点敲入LDHB表达盒，LDHB-hiPSCs保持正常核型和多能性标志物（OCT4、SOX2、NANOG）表达，且在LA或LA+2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）处理下存活率显著高于野生型（WT）hiPSCs，表明LDHB保护hiPSCs免受LA诱导的细胞死亡。

**LDHB-hiPSCs增强iHSPC生成效率**：基于单层分化方案，LDHB-hiPSCs在分化后期产生的iHSPC数量显著多于WT hiPSCs；LDHB-iHSPCs表达典型造血标志物（CD43、CD45），且对LA诱导的细胞死亡更具抵抗力；集落形成单位（CFU）实验显示其多谱系分化能力与WT相似。

**LDHB-iNKs抵抗LA诱导的线粒体功能障碍和死亡**：LDHB-iNKs表达典型NK受体，在15 mM LA长期培养下维持更高细胞数量；TOMM20蛋白水平、线粒体膜电位、ATP和NAD⁺水平均得到恢复，证明LDHB表达挽救了LA诱导的线粒体损伤。

**LDHB-iNKs显示增强的细胞毒性**：在15 mM LA条件下，LDHB-iNKs对U87和SKOV3肿瘤细胞的杀伤能力显著优于WT iNKs；即使在无LA或低浓度LA（5 mM）条件下，LDHB-iNKs也表现出更强的肿瘤抑制，尤其在低E:T和第二次杀伤时；LDHB过表达降低了重复杀伤后耗竭标志物TIM-3的表达，并提高了细胞内丙酮酸/乳酸比值，提示其主要通过代谢重编程（而非抑制乳酸摄取）促进功能，且ATP产量得到恢复。

**LDHB-iNKs在肿瘤中显示增强的存活和优越的抗肿瘤活性**：在U87皮下移植瘤模型中，LDHB-iNKs注射72小时后在肿瘤组织中的存活数量显著高于WT iNKs；在三次剂量治疗中，LDHB-iNKs组肿瘤体积和重量均显著小于WT iNK组，表明LDHB-iNKs具有更好的体内抑瘤能力。

**总结与讨论**

研究结论部分指出：LDHB在干细胞来源NK细胞中的表达不仅能克服LA诱导的功能障碍，还能促进其肿瘤抑制功能；LDHB-iNKs在不同肿瘤细胞中表现出增强的细胞毒性，尤其在低E:T比或低浓度LA存在下；此外，基于小鼠模型，LDHB-iNKs在肿瘤组织中显示更好的存活及对肿瘤形成的更强抑制。讨论部分强调，LA通过诱导NK细胞线粒体碎裂和赖氨酸乳酰化（Kla）降低细胞毒性，而LDHB通过将乳酸转化为丙酮酸，为柠檬酸循环提供额外ATP，从而改善线粒体健康。LDHA和LDHB作为乳酸代谢的关键酶，其同工酶谱的差异提供了调控代谢状态的特异性机制。本研究为通过重塑LDH同工酶谱改善NK细胞抗实体瘤疗法提供了新策略。