《Stem Cell Reports》：Cortical organoids reveal human-specific role of METTL5 in neurodevelopment via regulation of CHCHD2
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甲基转移酶样蛋白5（METTL5）催化18S rRNA上的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。在人类中，METTL5的功能缺失突变导致严重的小头畸形和智力残疾，而Mettl5敲除（KO）动物模型则表现出不一致且较轻微的表型。为了更好地模拟人类疾病，研究人员生成了ME
甲基转移酶样蛋白5（METTL5）催化18S rRNA上的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。在人类中，METTL5的功能缺失突变导致严重的小头畸形和智力残疾，而Mettl5敲除（KO）动物模型则表现出不一致且较轻微的表型。为了更好地模拟人类疾病，研究人员生成了METTL5-KO人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的皮层类器官，这些类器官表现出神经祖细胞（NPC）增殖和分化受损，导致脑室样结构减少和皮层类器官直径显著减小。机制上，核糖体测序（Ribo-seq）分析揭示了METTL5-KO NPC中广泛的翻译变化，与细胞应激反应一致，而非转录本特异性的翻译变化。单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现含卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域2（CHCHD2）下调，CHCHD2是氧化代谢的线粒体调控因子。在METTL5-KO NPC中过表达CHCHD2可挽救增殖，并部分挽救NPC中的氧化代谢和类器官中的脑室形成。这突显了CHCHD2、氧化代谢与METTL5介导的人类神经发生调控之间先前未被描述的关联。
**论文解读：METTL5通过调控CHCHD2在人类神经发育中发挥特异性作用**
**研究背景与问题**
RNA修饰在基因表达调控中扮演关键角色，其中N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA和rRNA上最丰富的修饰之一。甲基转移酶样蛋白5（METTL5）被鉴定为催化18S rRNA上单个位点（A1832）m6A修饰的酶，该位点邻近核糖体解码中心，提示其参与翻译调控。人类遗传学研究显示，METTL5的双等位基因功能缺失突变导致严重小头畸形（平均头围低于均值3.6个标准差）和智力残疾，并伴有癫痫、颅面缺陷、生长迟缓和攻击行为等附加症状。然而，Mettl5敲除小鼠模型并未表现出明确或一致的小头畸形表型，且认知障碍的评估在行为学上存在间接性。这种跨物种的表型不一致性提示METTL5功能可能具有细胞类型或物种特异性。因此，研究人员利用人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的皮层类器官，建立了首个三维人类特异性模型，以阐明METTL5在人类神经发育中的机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过CRISPR/Cas9技术在三种不同背景的hiPSC/hESC系（KOLF2.1J、H9、WTC11）中敲除METTL5，并分化为皮层类器官。结果显示，METTL5敲除（KO）类器官在多个时间点（第40、55、75天）出现脑室样结构数量显著减少和直径减小，精确再现了人类小头畸形表型，而小鼠模型未观察到类似现象。机制上，Ribo-seq分析揭示METTL5-KO NPC中发生广泛的翻译抑制，而非转录本特异性变化，并且多聚核糖体谱显示单核糖体峰增加、多聚核糖体与单核糖体比值降低。单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，METTL5-KO类器官中神经祖细胞（NPC）比例降低，应激细胞比例升高，其中卷曲螺旋-螺旋-卷曲螺旋-螺旋结构域2（CHCHD2）是最显著下调的基因。CHCHD2是线粒体氧化代谢的调控因子，参与氧化磷酸化和应激反应。在METTL5-KO NPC中过表达CHCHD2可完全挽救细胞增殖缺陷，部分恢复氧化代谢（最大呼吸能力恢复约50%），并在类器官中使脑室样结构数量恢复约53%。这些发现揭示了METTL5通过调控CHCHD2影响线粒体功能，进而驱动人类神经发生的全新通路。该论文发表在《Stem Cell Reports》。
**关键技术方法**
研究人员使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物电转染法，在KOLF2.1J（Jackson实验室，男性，55-59岁，白种/英国裔）、H9（WiCell，女性，来自囊胚）和WTC11（Coriell研究所，男性，30岁，亚洲/日本裔）三种hiPSC/hESC系中敲除METTL5。通过合成导向RNA靶向METTL5外显子1，经Sanger测序和ICE分析验证编辑效率，分离单克隆并验证蛋白和修饰水平缺失。采用改良的Kadoshima等方案分化皮层类器官，在低附着板中聚集后经神经诱导、扩增和成熟阶段培养至第75天。利用Ribo-seq（核糖体足迹分析）结合RNA-seq评估翻译效率，使用PIPseq（颗粒模板化即时分区测序）进行scRNA-seq，并通过Seurat和edgeR分析差异表达与细胞组成。使用Seahorse XF Mito Stress Test测量线粒体耗氧率（OCR）。构建Tet-On 3G系统诱导CHCHD2过表达（C端3xFLAG标签），通过慢病毒转导METTL5-KO iPSC，经嘌呤霉素筛选获得稳定系。
**研究结果**
**METTL5-KO皮层前脑类器官再现人类小头畸形表型**
通过测量第40、55、75天类器官直径和脑室样结构数量，发现METTL5-KO组在所有时间点脑室样结构显著减少，第55和75天直径显著减小，且三种细胞系均验证了这一表型，表明METTL5对人类皮质发育至关重要。
**METTL5在放射状胶质细胞（RGC）中高表达，是正常分化速度所必需的**
免疫荧光显示METTL5在NESTIN阳性RGC中强表达，而在小鼠胚胎E17.5的Nestin阳性细胞中未检测到，提示人类特异性。METTL5-KO类器官中PAX6阳性RGC在第40天减少，TBR2阳性中间祖细胞（IPC）在第40和55天均减少，第75天CTIP2阳性深层神经元显著减少，表明神经发生延迟。
**METTL5驱动RGC在3D和2D中的增殖与分化**
第55天类器官中，METTL5-KO组Ki67和PH3阳性细胞沿脑室壁减少。2D NPC增殖实验显示，METTL5-KO NPC在第2、4、6天细胞数显著低于对照。神经分化实验至第20天，METTL5-KO组TUJ1阳性神经元极少，细胞仍维持NPC形态；第30天，对照细胞表达TBR1和CTIP2，而KO细胞仍为TBR2阳性，证实分化受阻。凋亡检测（cleaved caspase-3）无显著差异，排除凋亡影响。
**METTL5调控iPSC和NPC中的全局翻译水平**
多聚核糖体谱分析显示，METTL5-KO iPSC中单核糖体峰增加，多聚核糖体/单核糖体（P/M）曲线下面积比降低70%；NPC中降低57%。Ribo-seq分析发现236个转录本翻译效率显著降低（23.1%），1224个升高（9.6%），但未见转录本特异性基序富集，仅前100个下调转录本的5'UTR中富集嘧啶富集翻译元件（PRTE）基序。RNA-seq显示10452个基因显著差异表达，其中2492个基因在转录和翻译水平均变化，富集于核糖体生物合成和应激通路。
**scRNA-seq揭示METTL5-KO和对照第75天类器官的差异细胞组成**
使用PIPseq对41933个对照和33973个KO细胞进行分析，鉴定出16个细胞群。METTL5-KO类器官中应激细胞（高表达MT-ND1、DDIT3、HSPA5）比例增加，RGC减少。差异表达分析发现1218个基因显著变化，CHCHD2是最显著下调基因。
**CHCHD2在METTL5-KO类器官和NPC中显著下调**
qPCR和Western blot验证CHCHD2在RNA和蛋白水平均大幅降低，几乎不表达。CHCHD2是线粒体间隙蛋白，调控氧化磷酸化和应激反应。
**CHCHD2过表达显著改善METTL5-KO细胞代谢、增殖和类器官生长**
在METTL5-KO NPC中诱导CHCHD2过表达后，Seahorse实验显示最大呼吸能力和备用呼吸能力部分恢复（约50%），NPC增殖率在第6天恢复至对照水平，第40天类器官脑室样结构数量平均增加53%。这些结果证明了CHCHD2在METTL5相关神经表型中的关键作用。
**总结与讨论**
本研究首次利用人类皮层类器官模型证明，METTL5缺失导致18S rRNA m6A修饰丢失，引起全局翻译抑制和细胞应激，进而通过转录下调CHCHD2损害线粒体氧化代谢，最终导致NPC增殖和分化缺陷及小头畸形。CHCHD2过表达可部分挽救代谢、增殖和类器官结构缺陷，表明该通路是METTL5突变引起人类小头畸形的关键驱动因素。与小鼠模型不同的是，人类NPC具有高度代谢需求，可能对CHCHD2缺失更敏感，这解释了物种特异性表型。此外，PRTE基序的富集提示METTL5可能与mTORC1通路相互作用。本研究强调，METTL5的功能在特定发育背景下（如高代谢需求的人类大脑）尤为重要，间接的下游效应（如CHCHD2）而非直接翻译调控可能是神经表型的主要驱动因素。
**研究结论**
综上所述，研究人员提出METTL5在细胞具有高代谢需求（如发育中的人类大脑）的背景下尤为重要，CHCHD2的下游失调可能是人类特异性神经表型的关键驱动因素。该研究揭示了METTL5-CHCHD2-氧化代谢这一新通路，为理解RNA甲基化在人类神经发育障碍中的作用提供了重要见解。
